叶绿体类囊体膜磷酸酯酶的提取和测定.pdfVIP

叶绿体类囊体膜磷酸酯酶的提取和测定 磷酸酯酶广泛存在于植物体的各种组织中，它水解磷酸单酯类物质，释放出磷酸基团，因此 磷酸酯酶的作用直接连接能量代谢、代谢调节和多种途径的细胞信息传递。提取磷酸酯酶的方法 视材料的不同而有所不同，在此介绍的是一种从植物叶绿体类囊体膜上分离磷酸酯酶的方法。以 对硝基酚磷酸盐 （pNPP）为底物，测定磷酸酯酶的活性。 1.仪器设备 组织捣碎器、Beckman 冷冻高速离心机、分光光度计、磁力搅拌器等。 2.操作方法 1）叶绿体的制备：洗净的菠菜叶片去叶脉，加STK 缓冲液（0.4mol/L 蔗糖，50mmol/L Tris-HCl， 10mmol/LKCl，pH7.8），在匀浆器中捣碎，通过4 层纱布过滤，滤液经1000×g 离心2min，取 上清液经6500×g 离心15min 后弃上清液，沉淀用重蒸水悬浮使叶绿素浓度为1.8～2.0mg/ml （叶 绿素浓度用Arnon 法测定，所有的操作均在4℃下进行）。 2）酶的提取：在上述叶绿体悬浮液中加等体积冷冻的正丁醇，搅拌2min，出现糊状后，经 15000×g 离心10min，仔细吸出下层液相溶液；然后再以100000×g 离心，30min （2℃），保留 上清液。在室温下加硫酸铵于上清液中 （硫酸铵饱和度为60%）沉