食品生物化学实验指导 课件 第八章 综合性实验 实验四 植物多酚氧化酶（PPO）提取与性质研究.pptx

食品生物化学实验指导 实验四 植物多酚氧化酶（PPO）提取与性质研究 第八章 综合性实验 一、实验目的 掌握植物中提取多酚氧化酶的方法，了解多酚氧化酶在植物中的分布；研究酶抑制剂对多酚氧化酶的抑制效果。 二、实验原理 多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。 二、实验原理 多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适pH为6～7。由多酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。 多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。酶是生物催化剂，其催化活性易受各种因素的影响，如温度、pH、底物种类、底物浓度、酶浓度以及抑制剂和蛋白质变性剂等都会改变其生物催化活性。 本实验将采用马铃薯为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。 三、实验试剂与器材 1. 材料 马铃薯 2. 试剂 pH 6.8的0.1mol/L磷酸钾缓冲液（内含20mmol/L抗坏血酸）、0.025mol/L邻苯二酚溶液、牛血清蛋白标准溶液（l.0mg/mL）、酶抑制剂二氢杨梅素、芦丁溶液（用50％乙醇溶解）、酶抑制剂抗坏血酸、50g/L三氯乙酸溶液、硫脲、固体硫酸铵、0.2％和0.3％（体积分数）的乳酸溶液、5g/L的碳酸钠溶液、0.1g/L碳酸钠溶液。 异抗坏血酸溶液（用纯净水溶解）、酶抑制剂肉桂酰甘氨酸甲酯溶液用二甲基亚砜（DMSO）溶解。 三、实验试剂与器材 考马斯亮蓝试剂：称量100mg考马斯亮蓝G250，溶于50mL 95％的乙醇后，再加入120mL 850g/L的磷酸，加水至l000mL。 0.1mol/L NaF溶液: 将4.2g氟化钠溶于1000mL水中。 0.01mol/L 邻苯二酚溶液:将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中，用稀NaOH调节溶液的pH为6.0，防止其自身的氧化作用。当溶液变成褐色时，应重新配制。新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。 0.01mol/L 间苯二酚溶液:将0.11g间苯二酚溶解于100mL水中。 0.01mol/L 对苯二酚溶液:将0.11g对苯二酚溶解于100mL水中。 0.8％HCl：19.2mL浓盐酸加水稀释到1000mL。 3. 仪器 分光光度计（带自动扫描功能）、冷冻离心机、电热恒温水浴锅、涡旋混合器、pH计、组织匀浆机。 四、实验步骤 1. 多酚酶活性的测定：参见第六章 实验六 2. 酶抑制剂对多酚氧化酶活性的抑制作用：参见第六章 实验六 3. 多酚氧化酶的催化作用 按表8-3加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表8-3 多酚氧化酶的催化作用 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后37℃保温5～10min，观察颜色变化 1 15滴 15滴 －   2 15滴 － 15滴   3 － 15滴 15滴 四、实验步骤 4. 多酚氧化酶的化学性质 按表8-4 加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表8-4 多酚氧化酶的化学性质 试管号 酶液 50g/L三氯乙酸 硫脲 振荡混匀后分别加入邻苯二酚15滴，于37℃保温10min，观察颜色变化 1 15滴 － －   2 15滴 15滴 －   3 15滴 － 少许 四、实验步骤 5. 底物专一性 按表8-5加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表8-5多酚氧化酶的底物专一性 试管号 酶液 邻苯二酚 间苯二酚 对苯二酚 混匀后37℃保温5～10min，观察颜色变化 1 15滴 15滴 － －   2 15滴 － 15滴 －   3 15滴 － － 15滴 四、实验步骤 6. 底物浓度的影响 按表 8-6加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 表 8-6 底物浓度的影响 试管号 酶液 邻苯二酚 水 混匀后37℃保温1min，观察颜色变化 1 5滴 1滴 39滴   2 5滴 10滴 30滴   3 5滴 40滴 － 四、实验步骤 7. 酶浓度的影响 按表8-7