高压氧下大鼠脑缺血区域脑组织基质金属酶-9表达及促进大鼠脑缺血损伤恢复的机制.docxVIP

高压氧下大鼠脑缺血区域脑组织基质金属酶-9表达及促进大鼠脑缺血损伤恢复的机制 高压氧治疗脑损伤可归因于改善的氧分压，保持大脑瘫痪的完整性，减少脑水肿，减少炎症损伤，降低脂质过氧反应，遏制细胞坏死等机制。然而，高压氧治疗脑损伤的精确机制尚不清楚。基质金属酶-9 (MMP-9) 被认为参与了脑缺血缺氧后的病理生理过程, 脑缺血时MMP-9上调并且可以直接导致神经元死亡, 而应用广谱MMP-9抑制剂或抗体可减少脑梗死的体积。本研究通过观察高压氧对大鼠脑缺血区域脑组织MMP-9的表达, 探讨高压氧治疗下大鼠脑缺血的作用机制, 现报道如下。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 wi企业模型分组 健康成年Wistar鼠32只, 雌、雄不限, 体质量250~300 g。采用随机数字表法将32只成年Wistar鼠分为模型组 (16只) 和假手术组 (16只) , 两组均分别行高压氧治疗 (8只) 和高压空气治疗 (8只) 。高压空气组与高压氧治疗组在时间、治疗次数方案上相同, 均1次/d, 共3 d。 1.1.2 小鼠卵白素-生物素过氧化酶开环小鼠igg、小鼠igg及卵白素-生物素过氧化酶体系表1 主要试剂有ELISA试剂盒、小鼠抗GAP-43单克隆抗体 (试剂号G9264, SIGMA) 、生物素结合的马抗小鼠Ig G及卵白素-生物素过氧化酶复合物 (ABC 1∶100, Vector) 。主要仪器有恒温电热干燥箱、高压氧舱、leitz Kryomat l700型组织冰冻切片机 (德国) 、荧光显微镜、紫外分光光度计及显微图象分析系统等。 1.2 方法 1.2.1 脑缺血动物麻醉后效果 参考Longa线栓法制作脑缺血模型, 所有大鼠均以左侧为栓塞侧。试验动物10%水合氯醛 (3 ml/kg) 腹腔注射进行麻醉后仰卧固定于手术台上, 取颈正中切口, 分离左颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉以及颈外动脉的分支, 将尼龙丝从颈外动脉插入颈内动脉直至阻断大脑中动脉起始处, 缝合皮肤切口。脑缺血动物麻醉清醒后可表现为提尾后右侧前肢屈曲内收, 爬行时向右侧转圈, 凡具备以上体征方可入选本实验。假手术组除不插线外, 其余步骤同上。 1.2.2 降压和治疗时间 (1) 高压氧治疗:用纯氧8~10L/min流量洗舱10~15 min, 使舱内氧浓度95%, 20 min内缓慢加压至0.25 MPa后停留60 min, 这期间用纯氧通风10 min, 停留结束后以20 min匀速减压至常压, 结束治疗; (2) 高压空气治疗:维持舱内氧浓度在21%, 压力至0.25 MPa后停留60 min, 停留结束后以20 min匀速减压至常压, 结束治疗。 1.2.3 脑含水量检测 分别取左右大脑半球的后半部分用干湿法测定。大鼠处死后立即开颅, 取缺血侧或假手术侧大脑半球后部一块全层脑组织, 装入称量杯称取湿重后, 放入恒温电热干燥箱105℃烘烤至恒重为止, 按Elliott公式计算含水量 (%) = (湿重―干重) /湿重×100%。 1.2.4 eb含量测定 分别取左右大脑半球的前半部分用甲酰胺法测定。取缺血侧或假手术侧大脑半球前部一块全层脑组织, 称取重量后加入甲酰胺, 水浴, 取脑EB液测定光密度, 波长632 nm, 蒸馏水作空白比色, 按标准曲线计算EB含量。 1.2.5 载体的制备 取大脑皮层脑组织匀浆, 用ELISA试剂盒检测MMP-9。用纯化的MMP-9抗体包被微孔板, 制成固相载体, 往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的MMP-9抗体、HRP标记的亲和素, 经过彻底洗涤后用底物 (TMB) 显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色, 并在酸的作用下转化成最终的黄色, 颜色的深浅和样品中的MMP-9呈正相关, 用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度 (值) , 计算样品浓度。 1.3 统计方法 应用SPSS 14.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差表示, 采用t检验。P0.05为差异有统计学意义。 2 假手术组与高压空气治疗mmp-9的比较 治疗第4天大鼠模型组在高压氧治疗下脑含水量、脑组织EB定量及MMP-9含量均小于高压空气下的治疗, 差异均有统计学意义 (均P0.05) 。假手术组在高压氧下治疗和高压空气治疗的差异均无统计学意义 (均P0.05) 。见表1, 2, 3。 3 模型大鼠脑缺血再灌注前后eb含量的变化 组织缺血、缺氧是脑缺血性损伤的最直接原因。大脑中动脉 (MCA) 阻塞后, 脑组织氧分别降低50%~90%, 脑血流 (CBF) 降低70%~90%, 皮层诱发电位 (CEF) 幅度在缺血半球降低20%~95%, 高压氧治疗具有增加血氧含量、提高动脉氧分压 (Pa O 模型组脑组织EB定量检测发现, 高压氧治疗脑组