丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备.pptVIP

项 目 三 丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备 当前第1页\共有39页\编于星期四\15点 第 1 组 第 2 组 第 3 组 第 4 组 第 5 组 第 6 组 第 7 组 第 8 组 一、汇报交流方案 当前第2页\共有39页\编于星期四\15点 二、讨论确定方案 SDS制备SHMT SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）是一种在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中加入SDS和巯基乙醇，以消除蛋白质分子所带的净电荷和形状对电泳迁移率影响的电泳技术。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中待检蛋白质的迁移率主要依赖于其相对分子质量，因此被广泛用于测定蛋白质的相对分子质量。 当前第3页\共有39页\编于星期四\15点 十二烷基硫酸钠是一种阴离子去污剂，与蛋白质结合可形成蛋白质-SDS复合物，由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原来的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别。 当前第4页\共有39页\编于星期四\15点 在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中加入SDS和巯基乙醇，能掩盖不同蛋白质间的电荷差异，并引起蛋白质构象变化，从而导致变性后的蛋白质分子在凝胶电泳中的迁移率取决于其相对分子质量大小，而与其他因素（原有电荷、形状）无关。通过这种电泳方式可将细胞中所有蛋白质根据各自的相对分子质量大小而分离开来。 当前第5页\共有39页\编于星期四\15点 电泳方向 混合样品 电泳 带孔胶 大分子 小分子 当前第6页\共有39页\编于星期四\15点 SHMT的电泳制备操作流程 安装电泳槽 剥胶 电泳 上样 制胶 染色 当前第7页\共有39页\编于星期四\15点 三、关键操作 试剂配制 制胶 剥胶 当前第8页\共有39页\编于星期四\15点 四、方案实施 清洁 领取物料 操作 填写生产记录 清场与清洁 当前第9页\共有39页\编于星期四\15点 SHMT的电泳制备 安装电泳槽 剥胶 电泳 上样 制胶 染色 当前第10页\共有39页\编于星期四\15点 材料：大肠杆菌培养物悬液（含SHMT） 器材：（1）夹心式垂直板电泳槽；（2）直流稳压电源（电泳仪）；（3）培养皿及竹夹子；（4）长针头（8~10cm）及普通针头；（5）注射器（10ml）；（6）微量进样器（50μl）；（7）细长皮头吸管；（8）移液管架；（9）棕色试剂瓶；（10）白色试剂瓶；（11）1ml 、2ml、5ml吸量管；（12）卷纸1包；（13）大平皿，（14）移液枪（配20μl枪头）。 （一）材料与仪器 当前第11页\共有39页\编于星期四\15点 夹心垂直板电泳槽示意图 1：导线接头 2：下贮槽 3：凹形橡胶框 4：梳子 5：固定螺丝 6：上贮槽 7：冷凝管 凝胶模示意图 1：梳子 2：长玻璃板 3：短玻璃板 4：凹形橡胶框 当前第12页\共有39页\编于星期四\15点 当前第13页\共有39页\编于星期四\15点 （二）试剂及配制 （1）30%丙烯酰胺储存液 称取丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g，加热至37℃溶解，蒸馏水定容至100mL，装于棕色瓶，4℃保存。 （2）1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）缓冲液 称取Tris 18.17g，加蒸馏水溶解，浓盐酸调pH至8.8，定容至100mL。 （3）1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）缓冲液 称取Tris12.12g，加蒸馏水溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100mL。 当前第14页\共有39页\编于星期四\15点 （4）10%SDS溶液 称取SDS 10.0g，加蒸馏水，68℃助溶，定容至100mL。 （5）10%过硫酸铵溶液 称取1.0g过硫酸铵，加水定容至10mL，4℃保存。 （6）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3） 称取Tris 15.1g、甘氨酸94g、SDS 5g，加水定容至1L，室温存放，使用时稀释5倍使用。 当前第15页\共有39页\编于星期四\15点 （7）考马斯亮蓝R250染色液 在45mL甲醇、45mL水和10mL冰乙酸的混合液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250，用滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。配制500mL。 （8）脱色液 75mL冰乙酸，50mL甲醇，875mL水，混匀即可。 （9）2×SDS凝胶加样缓冲液 配5mL：取1mol/L Tris-HCl （pH6.8）0.5mL，SDS 0.2g，溴酚兰10mg，甘油1mL，加水定容至5mL，与样本混匀前加0.16g DTT。使用时与样本l∶1（v/v）混匀。 当前第16页\共有39页\编于星期四\15点 （10）样品处理 大肠杆菌培养物悬液 →离心（3000r/min，5min）→蒸馏水悬浮细胞→加2×SDS加样缓冲液（1:1）→沸水加热10min →离心（