不同C-N条件下菌酶制剂对牛粪堆肥中细菌多样性的影响.docxVIP

? ? 不同C/N条件下菌酶制剂对牛粪堆肥中细菌多样性的影响 ? ? 梁天，张晓东，张玉，张佐忠，斯日古楞，苏布登格日勒，娜仁花 （内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018） 堆肥是由细菌、真菌和其他微生物共同作用分解有机物质的过程。为了加速生物性降解，通常接种几种功能菌株进入堆肥中，以加快腐殖质的形成和缩短堆肥周期[1]。在堆肥初期，畜禽粪便中土著微生物含量少，且厌氧菌在系统中占据优势，导致堆体升温缓慢，并容易产生恶臭，而添加外源微生物菌剂后可明显改善这一现象。Zhao等[2]研究认为，接种有助于提高初始微生物种群和加快堆肥成熟进程。Sarkar等[3]报道，接种可以延长堆肥高温期，提高细菌和真菌群落的多样性，进一步增加腐殖酸和类黄腐酸化合物的分子量和腐殖化程度。此外，外源微生物接种不仅可以增加堆肥过程中的微生物活性进而促进堆肥的成熟，而且还可以提高有效微生物浓度，从而迅速提高堆肥速率、温度，并提高底物特异性微生物的丰度[4]。 在堆肥过程中，有机物降解和腐殖质的形成都离不开微生物酶的生物化学作用，通过有目的的腐解作用，将有机物转化为养分和活性物质。任平等[5]研究发现，添加复合酶处理可促进牛粪堆肥前期纤维素类物质的分解转化，从一开始就对整个发酵起到积极作用。酶对堆肥内纤维素物质的快速降解有利于好氧微生物的快速增殖，从而迅速分解物料中的有机质，产生大量的生物热，加速物料的升温，延长发酵的高温期，进而缩短发酵周期。 本研究通过不同C/N条件下，在牛粪中添加不同菌种和酶剂组合，探究在牛粪堆肥进程中细菌的多样性演替变化规律，以期为堆肥高效发酵提供技术依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 牛粪和小麦秸秆均取自内蒙古某奶牛养殖场。将小麦秸切碎至1～2cm长度。菌剂包括枯草芽孢杆菌（有效活菌数200亿/g）、黑曲霉菌（有效活菌数50亿/g）、细黄链霉菌（有效活菌数50亿/g），3种菌配制成比例为1:1:1的复合菌剂。将纤维素酶（有效酶活为20万U/g）和蛋白酶（有效酶活为50万U/g）配制成比例为3:1的复合酶制剂。三种菌和两种酶均购自湖北某生物工程有限公司。牛粪及小麦秸秆的基本性质见表1。 表1 堆肥原料的基本性质 1.2 试验设计 堆肥试验于2020年9月28日-11月1日在内蒙古某奶牛养殖场彩钢瓦棚中进行。将牛粪和小麦秸秆按一定比例混合，分别设25/1、30/1、35/1三个C/N组，每个C/N组设三个处理组，每个处理3个重复。按质量比添加菌剂和酶制剂，具体分组见表2。 表2 堆肥处理组物料配比情况 各处理组的含水量调节在45%～60%之间。将物料进行条垛式堆肥，每个堆体长1.2m，堆底宽1m，高0.8m，每堆的堆体间隔为1～2m。所有处理组每隔5d人工翻堆一次。 1.3 取样方法 在堆肥开始的第1、5、10、15、20、26、34天进行取样。采样深度分别距堆体顶部20cm、40cm、60cm处，各层均采用五点采样方法取样，取样后混合均匀。每个堆体取500g样品，放入自封袋中，置于-80℃冰箱中保存。 1.4 测定指标与方法 1.4.1 发酵堆体中细菌多样性分析 通过高通量测序技术测定各处理组在堆体发酵过程中细菌多样性变化特征。 1.4.2 堆体微生物DNA的提取 根据FastDNA?Spin Kit for Soil（MP Biomedicals,GA, U.S.）说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度。 1.4.3 堆体微生物目标基因扩增 细菌16S rRNA基因使用338F/806R进行扩增，引物序列如表3所示。 表3 PCR扩增引物碱基序列 1.4.4 细菌16S rRNA-PCR 扩增 细菌扩增反应体系见表4。 表4 细菌PCR扩增反应体系 扩增反应参数：95℃预变性3min，之后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，此步骤循环27次，然后72℃稳定延伸10min，最后保存于10℃。PCR扩增产物大小为468bp。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。 1.5 微生物数据处理 利用FASTP软件对原始测序序列进行质控，用FLASH软件进行拼接。利用UPARSE软件对序列进行OTU聚类（相似度为97%）并剔除嵌合体。用RDP classifier对序列进行物种分类注释。使用美吉云平台进行图形制作与部分数据分析。 2 结果与分析 2.1 堆肥样品细菌OTU聚类分析和Alpha多样性分析 Venn图用来统计多组样本之间共有和独有的OTU个数，从而比较直观地表达不同组OTU组成的相似和重叠情况。如图1所示，处理组C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9组细菌分别有1795、1948、1931