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人参皂苷rg1对糖尿病大鼠脑卒中的治疗作用 糖尿病是一种严重的代谢性疾病，其中一半以上的患者患有血管并发症。 人参皂苷Rg1是临床脑卒中治疗药物的共有成分, 如金森胶囊、血塞通注射液等 Rg1具有降低2型糖尿病大鼠血糖含量和胰岛素含量 本研究采用高糖高脂饮食联合链脲佐霉素制备2型糖尿病大鼠模型, 在此基础上, 通过大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion, MCAO) 制作糖尿病脑卒中复合模型, 采用静脉注射Rg1的方式评价其对糖尿病脑卒中的治疗作用, 同时观察高迁移率族蛋白1 (high mobility group box1, HMGB1) 对其治疗作用的影响。 动物组织学检测 动物 雄性SD大鼠 (5周龄) , 购自北京维通利华实验动物技术有限公司 (清洁级, 合格证号:SCXK (京) 2016-0011) , 饲养于中国医学科学院药物研究所动物房, 室温24±1℃, 相对湿度 (55±5) %, 12 h/12 h明暗循环, 自由饮食, 饮水。 药品与试剂 脂肪供能比为60%高脂纯化饲料 (H10060) , 购自北京华阜康生物科技股份有限公司。链脲佐霉素 (STZ, 美国Sigma公司) ;血糖试纸 (三诺生物传感股份有限公司) ;异氟烷 (深圳瑞沃德实验技术公司) ;Iba-1抗体、HMGB1抗体 (Abcam公司) ;Iba-1 (日本Wa Ko公司) , Alexa 488-二抗、Hoechst33342 (Life Technology公司) ;ECL发光液 (北京普利莱生物技术有限公司) 。 2型糖尿病大鼠模型的建立 经适应性饲养7天后, 给予大鼠高脂饲料喂养4周。4周后, 经禁食12 h, 单次STZ溶液 (枸橼酸缓冲液配制, p H 4.4) 注射, 剂量为35 mg·kg 动物分组及脑缺血再灌注模型的建立 选取成功诱导2型糖尿病大鼠, 按照血糖值随机分为假手术组;模型组;Rg1低、中、高剂量组 (10、20和40mg·kg 行为学评分 术后24 h进行动物行为学评分观察, 参照Longa方法, 提鼠尾离开地面约1尺, 观察两前肢状况;将大鼠置于水平地面, 推动其双肩, 观察两侧抵抗力有无差异;大鼠置于地面, 观察其行走情况。采用5分法 (0~4分) 对各组进行行为学评分, 分数越高, 说明其神经行为损伤越严重。 (1) 行为完全正常者, 记0分; (2) 提起鼠尾离开地面, 手术对侧前肢内旋者, 记1分; (3) 大鼠至地面, 手挤压两侧检查抵抗力, 抵抗力下降者, 记2分; (4) 大鼠至地面, 观察其行走, 围绕手术对侧转圈者, 记3分; (5) 损伤极其严重, 已无法自主活动者, 记4分。 大鼠脑梗死率 (infract area percent, IAP) 和水肿系数 (edema factor, EF) 的测定 脑组织称湿重后迅速置于-20℃冰箱中, 30 min后置室温, 将大鼠脑置于切片模具中, 切除嗅球、小脑和低位脑干后, 间隔2 mm冠状切片, 共计6片。然后迅速将脑片置于5 m L含1%2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑 (TTC) 的磷酸盐缓冲液 (PBS) 中, 37℃恒温避光孵育30 min, 期间每隔5 min将脑片翻动1次。经TTC染色后, 正常组织呈玫瑰红色, 梗死组织未被染色而呈白色。取出脑片放入10%福尔马林中固定。将每组脑片排列整齐, 拍照保存。应用Imagepro Plus图像分析软件处理并作统计, 计算每张脑片的梗死面积, 假定每张脑片的梗死面积为A, 患侧脑片的面积为B, 健侧的面积为C。IAP= (A 免疫细胞的检测 术后24 h进行水合氯醛麻醉 (350 mg·kg 炎症因子的检测 采用q PCR方法进行检测, 具体操作:大鼠断头处死, 冰上分离受损侧大脑皮层组织, 采用Trizol提取总RNA, 经反转录后进行实时荧光定量PCR检测, 检测指标包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、白介素1β (IL-1β) 和诱导性一氧化氮合成酶 (i NOS) 。 HMGB1蛋白水平的检测 大鼠断头处死, 冰上分离受损侧皮层, 采用RIPA裂解液超声破碎, BCA法测定蛋白浓度, 加入1/4体积5×loading buffer后95℃处理10 min, 样品于-40℃保存。蛋白上样量70μg, 分离胶浓度12%, 将蛋白转印至PVDF膜后以5%BSA封闭1 h, HMGB1抗体4℃孵育过夜, PBS洗5 min×3次, 二抗室温孵育2 h, PBS洗5 min×3次, 加入ECL发光液显影。使用Quality one 4.6.2凝胶分析软件对蛋白条带进行灰度分析。 侧脑室注射HMGB1抗体或HMGB1蛋