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高产-氨基丁酸发酵梨酒的研究 氨基丙烯酸（氨基丙烯酸）是一种非蛋白质的天然氨基酸，广泛存在于植物、动物和微生物中。 目前,采用微生物发酵已经开发的富含GABA食品有发酵乳 1 材料和方法 1.1 仪器、试验设备 鸭梨、雪梨河北省赵县产; 溴甲酚绿天津市百世化工有限公司,分析纯; 琥珀酸天津市博迪化工有限公司,分析纯; 50% 乙醛酸溶液上海源叶生物科技有限公司。 SP-722E型分光光度计上海光谱仪器有限公司; SPX-250B-II型生化培养箱上海贺德实验设备厂; 安捷伦6820 高效气相色谱仪美国惠普公司。 1.2 果汁初筛、分离、培养 YPD培养基: 葡萄糖20 g / L,蛋白胨20 g / L,酵母浸粉10 g / L,琼脂20 g / L,p H自然;GABA筛选培养基 选择糖分含量高、香气浓、充分成熟、无霉烂果的梨果,去核、不去皮,用螺杆式榨汁机榨汁。分别取100 m L果汁于250 m L锥形瓶中,并加入适量果渣。加入5% 亚硫酸钠溶液,使得果汁SO 将发酵后的梨汁进行适当稀释后涂布到GABA筛选培养基上,于30 ℃ 恒温培养箱中培养3 d。观察菌落颜色和形态,挑取具有酵母形态、绿色较深的菌株进行分离纯化。纯化菌株保藏于试管斜面,并保存于4 ℃ 冰箱中。将初筛出的高产GABA菌株,接种YPD液体培养基,活化24 h后接种到WL琼脂培养基,30 ℃ 培养3 d后观察,挑选出浅黄色- 绿色、表面光滑、球形突起的、不透明的菌株。 将初筛得到的高产GABA菌株,分别接种到100 m L发酵培养基、梨汁发酵培养基中,30 ℃静置发酵6 d。待发酵结束后测定发酵液中GABA的含量和酒精含量。 1.2.5 高产加巴酒祖母的鉴定 1.2.6 梨汁的制备 在100 m L YPD液体培养基中,分别接入2~3 环斜面保藏的酿酒酵母KS45,30 ℃ 、180 r / min摇床培养2 d。 选择新鲜无病的成熟鸭梨,清水洗净、去核后,用螺杆式榨汁机榨汁,并用蔗糖调整其糖度为20% 。 将150 m L梨汁加入250 m L的三角瓶中,并按10% 接种量接入种子液,用8 层干净的纱布封口,在30 ℃ 下分别静置发酵4、6、8、10、12 d。 按10% 接种量向150 m L梨汁中接入种子液,分别在15、20、25、30、35 ℃ 下恒温静置发酵10 d。 将制备好的梨汁装入500 m L三角瓶中,装液量分别控制为100、200、300、400 m L,接入10% 种子液,分别在30 ℃下静置发酵10 d。 1.3 分析 1.3.1 gaba测试 梨酒蒸馏后,以正丁醇为内标物,采用气相色谱仪测定其乙醇含量。每个实验设置三个平行实验,测定酒精度,取其平均值。 2 结果与分析 2.1 复筛和分子鉴定 黄丽华等 将自然发酵后的梨汁进行适当稀释后涂布到GABA筛选培养基上,30 ℃ 培养3 d,其中一个平板的培养结果见图1。观察菌落颜色和形态,挑取出具有酵母形态、绿色较深的菌株进行分离纯化,获得了83 株高产GABA酵母菌株。WL培养基对酿酒酵母的筛选可信度达到100% 本研究的目的是获得富含GABA的梨酒,因此,复筛时采用了静置发酵。将初筛得到的高产GABA酵母菌株分别接种到发酵培养基进行静置发酵,发酵结束后,检测其中的GABA和酒精含量。实验发现,所有酵母菌株均产生不同浓度的酒精,但均检测不出GABA。分析其原因很可能是由于静置发酵时氧气供给太低造成的。与之相反,当将初筛得到的高产GABA酵母菌株在梨汁发酵培养基进行静置发酵时,发现所有酵母菌株在产生酒精的同时,均可检测到有不同浓度的GABA产生,这说明梨汁中可能含有刺激GABA合成物质。这些刺激GABA合成物质使得酵母菌能够在厌氧条件合成了较多GABA。在梨汁发酵培养基上经过复筛,共获得了8 株高产GABA酿酒酵母( 表1) ,其中菌株KS45 产生的GABA最多,达到了1.146 g / L。从表1 中还可以发现,普通酿酒用的安琪酿酒酵母可以产生酒精,但不产生GABA。菌株KS45 在高产GABA的同时,仍具有良好的产生酒精的能力,其发酵酒精度达到8% ,因此,本研究采用菌株KS45 来酿制富含GABA梨酒。菌株KS45 的菌落形态特征为: 乳白色,球形突起,表面光滑,不透明,奶油状( 图2) 。 酿酒酵母不能利用赖氨酸作为氮源,因而在赖氨酸培养基上不能生长。将复筛所得到GABA产量最高的酵母菌株KS45,接种到赖氨酸培养基进行培养,发现菌株KS45 不能在赖氨酸培养基形成菌落,因而基本上可确定菌株KS45 为酿酒酵母。为了更加准确和可靠,将菌株KS45 送交上海生工生物工程股份有限公司进行了分子鉴定。提取KS45 菌株的基因组DNA,用通用引物NS1 和NS6 进行扩增可知18S