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带细菌生物膜克氏针置入sd大鼠骨髓炎模型的建立 快速阅读文章 髓炎的发病部位 骨髓炎：骨的感染和损伤可由需氧或厌氧菌、分枝杆菌和真菌引起。骨髓炎发生在长骨和糖尿病患者的足部，或由伤口或手术引起的透性骨损伤部位。 生物膜：也称为生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体，生物膜细菌对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强。 0 细菌生物膜导致的骨髓炎 骨髓炎是骨的感染和破坏，可由需氧或厌氧菌、分枝杆菌及真菌等引起，其中最常见病原菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus) S.aureus成为骨髓炎感染的主要病原菌，在骨髓炎感染中75%为葡萄球菌，其中S.aureus占主要地位，S.aureus已成为一种威胁人类的主要病原体，导致各种疾病，从化脓性感染到威胁生命的感染如脓毒血症等 要探究骨髓炎的治疗方法，有效复制临床的骨髓炎模型是研究的基础和关键，在临床中以细菌生物膜导致骨髓炎的情况最多见，因此模拟细菌生物膜导致的骨髓炎模型对未来骨髓炎治疗的研究至关重要。以往均为直接滴加细菌进入钻孔内制作骨髓炎模型，与临床发病因素有明显区别，且滴入细菌悬液量不易控制，易导致模型动物死亡，此次研究建立新型S.aureus生物膜克氏针置入大鼠胫骨导致骨髓炎的模型，与临床内固定生物膜感染更加接近。 1 材料和方法 1.1 项目设计 1.2 时间和地点 实验于2019年9月至2020年6月在遵义医科大学基础1号实验楼3楼生物化学实验室完成。 1.3 动物饲养及适应性 SPF级雌性SD大鼠18只购自长沙市天勤生物科技有限公司，8周龄，体质量250 g左右，每笼饲养3只。给动物提供标准食物和水，实验前进行1周适应；所有动物的处理均遵照伦理规定进行，并通过遵义医科大学附属医院伦理审查委员会审查批准，批准号：KLLY-2019-074。 1.4 方法 1.4.1 培养筛选过程 将金黄色葡萄球菌ATCC25923(遵义医科大附属医院检验科提供)标准株接种于血琼脂平板上，37℃恒温培养箱中孵育24 h后取出，接种环无菌挑取单个菌落至15 mL的氯化钠肉汤(青岛海博生物，中国)培养液中，并置于37℃的恒温摇菌箱中孵育18 h，调整细菌浓度到1×10 1.4.2 克氏针内固定 腹腔注射3%戊巴比妥钠(遵义医科大学附属医院提供)30 mg/kg以麻醉大鼠。麻醉生效后固定大鼠四肢，右下肢备皮，碘伏消毒术区，铺一次性无菌治疗巾，在膝关节下沿胫骨前嵴内侧切开长约1 cm切口，在胫骨前肌内侧进入达骨膜，显露胫骨上端的前外侧面胫骨嵴，小心刮开骨膜，用直径1.5 mm钻头的手钻在此处钻骨洞，用小刮匙探查去除松质骨，将制备的带细菌生物膜克氏针头插入胫骨髓腔后用骨蜡将骨窗封闭，生理盐水反复冲洗后逐层缝合伤口，予单笼饲养，造模后观察4周，见图2。 1.4.3 骨髓炎感染血血流炎的观察 体温检测：造模前检测大鼠体温情况，造模后1周连续检测大鼠体温变化，采用肛测法测量大鼠体温，将体温计探头置入大鼠肛门内距肛门口1.5-2.0 cm深度，约20 s后读数，对比术前术后大鼠体温变化情况。 切口愈合情况：造模后观察切口部位愈合情况及有无流脓。 影像学检查：造模后第4周后所有大鼠行X射线(遵义医科大学附属医院影像科)检测造模部位，采用正、侧位摄片，观察骨组织愈合情况。 大体标本情况：造模后第4周过量麻醉处死大鼠，将大鼠造模胫骨取下去除软组织，观察骨洞愈合情况，有无隧道形成及流脓。 骨病理苏木精-伊红染色：将骨胫骨放入EDTA脱钙液(索莱宝，中国)脱钙，每天更换脱钙液，用细针试探脱钙程度，待可轻松刺入骨皮质时为宜，将标本送至遵义医科大学附属医院病理科行石蜡包埋病理切片并行苏木精-伊红染色。 细菌培养及鉴定：将大鼠处死后无菌取钻孔部位分泌物涂到血琼脂平板进行画线培养，观察有无细菌菌落生长，将培养出的细菌利用质谱仪(全自动快速微生物质谱检测系统，Automated microbial identification system，法国)进行质谱鉴定，鉴定是否为克氏针上所接种细菌导致感染。 炎症因子检测：造模前后检测炎症因子，造模前采取大鼠尾部采血法，造模第4周戊巴比妥麻醉大鼠后，心脏采血法抽取血液，用无菌管收集，室温血液自然凝固10-20 min,2-8℃条件离心20 min左右(2 000-3 000 r/min)，仔细收集上清，用大鼠降钙素原、肿瘤坏死因子α以及白细胞介素10的Elisa盒子(Elabscience，中国)进行检测，使用多功能酶标仪(Spectra Max M2e，美国)检测吸光度并计算浓度，对比造模前后大鼠炎症因子变化情况。 1.5 主要观察指标 大鼠体温变化、切口愈合及流脓情况、影像学检查、大体骨标本钻孔愈合情