dmso诱导hl-60细胞分化为类中性粒细胞的研究.docxVIP

dmso诱导hl-60细胞分化为类中性粒细胞的研究 中立颗粒（pmns）是骨髓血浆形成的最终分裂细胞。它是血液中最常见的细胞，约占每周细胞总数的50%70%，在血液循环中的正常生命周期为24-48小时。成熟的中性粒细胞通过自发性凋亡 (spontaneous apoptosis) 这一机制来维持自身数量和内环境的稳定 急性髓细胞性白血病细胞系 (HL-60) 为我们的研究带来了新的思路。HL-60是人早幼粒细胞白血病细胞系 (human leukemia) , 它能在体外长期培养并具有相对的遗传稳定性, 如果用化学药物对其进行诱导, HL-60细胞则可以表现出不同程度地向粒细胞、单核细胞分化的现象。例如, 二甲基亚砜 (dimethylsulphoxide, DMSO) 可以诱导HL-60细胞沿粒系统方向成熟分化, 这种经诱导分化而来的细胞形态比较特殊, 多呈分叶状, 像中性粒细胞一样具备吞噬能力, 而且还具有很多中性粒细胞的分子标志物, 如CB2受体、CD71、CD11b 本文以此作为研究的重点, 用DMSO诱导HL-60细胞, 并运用光学显微镜观察细胞形态、RT-PCR技术检测类中性粒细胞标志物CD11b基因的表达, 为确立类中性粒细胞可能成为中性粒细胞研究的替代模型提供理论依据。 1 1.1 培养基和试剂 HL-60细胞购自中国科学院上海细胞库。DMSO购自Sigma;Trizol购自Invitrogen公司;Dextran T-500购自Gibco公司;RPMI-1640培养基, 胎牛血清购自HyClone公司;RT-PCR试剂盒购自Takara公司;引物均由Invitrogen公司合成。 1.2 1.2.1 谷氨酰胺co-b HL-60细胞购自中国科学院上海细胞库。培养液为RPMI-1640 (含10% FCS, 10 mmol/L HEPES, 0.2 mmol/L 谷氨酰胺, 25 U/ml青霉素, 25 g/mL链霉素) , 于饱和湿度、5%CO 1.2.2 诱导hl-60的分裂 调整细胞数为2 × 10 1.2.3 rt-pcr检测cd11b表达量 CD11b和GAPDH引物序列分别为: CD11b-f:5’-GGCCTCAGAGAATACCAGT-3’;CD11b-r:5’-GGGTGAACACGGAATCGTT-3’。 GAPDH-452-f:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’;GAPDH-452-r:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。 总RNA的提取和CD11b表达量的检测分别参照Trizol试剂盒说明书和RT-PCR试剂盒进行。即首先获得cDNA, 以cDNA为模板分别扩增CD11b及GAPDH内参片段, 将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 使用凝胶定量软件Quantity-one分析系统进行扫描定量分析。 1.2.4 实验统计分析 所有数据均经过SPSS17.0 for windows软件进行统计分析。实验的结果取自一次代表性实验, 且被3次独立实验证实。计量资料以 2 2.1 dmso诱导hl-60细胞的形态 在倒置相差显微镜下观察各组细胞。对照组 HL-60细胞形态如图1 (a) 所示;用DMSO诱导HL-60细胞48h后细胞形态如图1 (b) 所示;用DMSO诱导HL-60细胞72h后细胞形态如图1 (c) 所示。由图1可见, 各诱导时间段的HL-60细胞透明, 立体感和遮光感效果佳, 细胞活性好。随着诱导时间的延长, 被诱导细胞的体积逐渐增大, 48 h后出现了肾形核、分叶核、蚕豆核等粒细胞核型, 并随时间的延长逐渐增多;采用台盼兰拒染试验及怀特-姬姆萨混合染色法鉴定各实验组细胞状态符合后续研究对细胞质量的要求。 2.2 结果图1 将提取获得的RNA进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳, 结果如图2所示。可见到28 S 和18 S 亚基清晰显示, 28 S 与18 S 的带宽比在1.8 ～ 2.0, 说明RNA完整性良好, 满足后续实验要求。 2.3 cd11b表达量的确定 RT-PCR结果如图3所示, 同空白组相比, DMSO处理后24 h开始, 即有CD11b的表达上升, 且随着时间延长, CD11b的表达量也逐步升高 (图3 (a) ) ;用Phoretix 1D软件读取各条带灰度值, 诱导至48 h后, 诱导组CD11b的表达量较对照组由显著差异 ( 3 类中性细胞的表达 本研究用DMSO诱导HL-60细胞, 采用光镜下观察细胞形态和利用RT-PCR技术分析分化标志物CD11b基因的表达, 从而以确定HL-60细胞是否成功分化为类中性粒细胞, 进而为利用类中性粒细胞为模型研究中性粒细胞自发性凋亡机制奠定基础。 外周血中性粒细胞为成熟的终末分化细