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复方守宫散对lewis肺癌小鼠jak2-sa3信号通路的影响 肺癌是对人类健康和生命的最大肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（gsc）占85%。化疗在中晚期非小细胞肺癌的治疗中发挥着重要作用, 但且化疗药物毒副作用较大, 使许多中晚期非小细胞肺癌患者难以坚持完成化疗。在我国, 现代医学结合中医药治疗肺癌是一大特色, 临床应用有效, 本实验将Lewis廇小鼠作为研究体系, 观察了中药与西药作用后癌基因STAT3信号通路相关蛋白JAK2、STAT3的表达, 为中医药的临床运用提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 国家动物房提供 C57BL/6J小鼠50只, 体重 (20±2) g, 雄性, 由安徽医科大学二附院动物房提供 (动物许可证号: 。小鼠Lewis肺癌细胞 (Lewis lung cancer cell line, LLC) , 中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供。 1.2 瘤细胞悬液的制备 细胞培养:复苏小鼠Lewis肺癌细胞, 贴壁生长于DMEM培养液中 (含10%灭活胎牛血清及100U/m L青霉素、链霉素) , 置37℃、5%CO2培养箱中。约3d传一代, 用0.25%胰酶消化。正常传3代后, 胰蛋白酶消化法制成细胞悬液, 台盼蓝染色计数活细胞率95%, 用PBS液调整活细胞浓度为2×107/m L, 取0.2m L瘤细胞悬液接种于每只C57BL/6J小鼠右侧前肢腋下皮下。国家标准固体混合饲料喂养。接种6d后, 以小鼠右侧前肢腋下皮下可触及米粒大小肿瘤块, 标志造模成功。 1.3 灌服复方守宫散 随机分为阳性对照组、高剂量复方守宫散组、中剂量守宫散组、低剂量守宫散组、顺铂组, 每组10只。实验第2天 (造模成功24h后) , 阳性对照组:灌服生理盐水0.2m L, 1次/d;中药组灌服复方守宫散高剂量组0.6m L (相当于120mg/kg) , 中剂量组0.4m L (相当于60mg/kg) , 低剂量组0.2m L (相当于40g/kg) , 1次/d;顺铂组按1mg/kg给药, 0.1m L/只腹腔注射。每天1次, 共14d。 1.4 试剂盒和培养基 (l) 复方守宫散 (安徽省中医院中药房) 。 (2) 顺铂 (江苏豪森药业股份有限公司, 国药准字H200408l3, 产品批号070902) 。 (3) (1) 电化学发光 (ECL) 试剂盒:美国pierce公司; (2) actin (购自北京中山公司) ; (3) DMEM培养基 (美国Gibco公司生产) ; (4) 山羊抗兔二抗、JAK2、STAT3 (北京博奥森生物技术有限公司) ; (5) 10%胎牛血清 (杭州四季青生物制品有限公司) 。 1.5 光学显微镜、气溶胶及成像系统 水浴恒温振荡器, 湘仪高速离心机, 生物安全柜, 光学显微镜, 包埋机, 手动石蜡切片机, 摊片机, 烘片机, 智能化组织脱水机, 电子天平, 高速冷冻离心机, 电泳仪, 凝胶自动成像及分析系统等。 1.6 观察指标 1.6.1 肿瘤抑制率测定 停药后第2日处死动物, 完整剥取肿瘤, 称重量, 计算肿瘤抑制率。抑瘤率= (对照组平均瘤重-实验组平均瘤重) /对照组瘤重×100%。 1.6.2 免疫总蛋白中a54和bsa3的表达 采用Western blot法。剪取肿瘤组织, 称重, 每个样品重量在100mg左右, 加入RIPA细胞裂解液1m L (内含1m M PMSF) 进行裂解。离心, 收集上清液, 即含有组织总蛋白。在收集的蛋白样品中加入等量的2X SDS蛋白上样缓冲液。沸水浴加热10min, 以充分变性蛋白。待样品冷却到室温后, 把蛋白样品直接上样到SDS胶加样孔内。每孔加15μL。浓缩胶所用电压为80V, 时间为30min;分离胶所用电压为120V, 时间为1h。将预先裁好与胶条同样大小的滤纸和PVDF膜 (预先在甲醇中浸泡3min) , 浸入转膜缓冲液中5min。接通电源, 恒流转膜。5%BSA在摇床上缓慢摇动, 室温封闭2h。分别用一抗:抗beta-actin抗体, 抗体属性为鼠抗;1︰1000稀释, 10%的分离胶;抗Jak2、Stat3抗体属性为兔抗;1︰1000稀释, 10%的分离胶抗。4℃缓慢摇动孵育过夜。加入洗涤液 (TBST) , 每次洗涤10min, 共洗涤3次。HRP标记的相应二抗1︰10000稀释液稀释, 室温封闭2h。加入洗涤液 (TBST) , 每次洗涤10min, 共洗涤3次。用ECL发光试剂盒说明来检测蛋白。 1.7 统计学处理 用SPSS17.0统计软件分析, 计量资料采用 (ue0af±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用取LSD-t检验, P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2