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hiv-gag病毒样颗粒疫苗免疫鼠血清免疫效果的研究 1981年首次发现这种疾病，共有1400万人死亡，疫情患者人数接近5000万人。我国自1994年后HIV感染进入快速增长期,以B、C亚型为主,估计到2010年感染者可能突破1 000万人,所以对HIV-1感染的预防以及与预防相关的问题应该有一个全面的评价,但最实际的需要是证明一种或几种有希望的候选疫苗能够进行人体试用。对暴露于HIV-1的个体,包括未采取保护的性伴侣、静脉途径的吸毒者和医务工作者的自然史研究发现,人的机体的确产生了保护性免疫应答。HIV-1自然史的许多研究表明,Th1型病毒特异性的细胞介导免疫与免疫保护相关。其它因子如γ干扰素(IFN-γ)、β-趋化因子对遭HIV-1感染有保护作用,其中包括细胞毒性T淋巴细胞活性和CD8病毒抑制活性起重要作用。我们实验室选用中国流行的HIV-1B、C亚型代表株,将其gag和gp120的V3区插入gag即gag-V3,以VLP形式在昆虫细胞中进行了表达。VLP疫苗是目前最有希望的疫苗之一,它与天然病毒十分接近,抗原性强,不带病毒核酸。观察我国VLP候选疫苗在小鼠的免疫效果包括体液免疫水平和与细胞因子水平相关的细胞免疫水平,对后期VLP疫苗的灵长类实验具有重要意义。 材料和方法 1 表达抗的制备 将表达HIV-1B亚型的gag和gag-V3的重组病毒感染Sf9细胞,72h收获上清,上清走8%聚丙酰胺电泳,进行Western blot分析。P55单抗及二抗由NIH AIDS Project赠送。阳性产物经PEG8000浓缩后15%蔗糖垫层超离(100,00g,6h,4℃)收集后,PBS稀释后离心(16 000r/min 40min 4℃)。得到纯的gag和gag-V3蛋白,将其溶在20mmol/L Tris-HCL pH7.5,150mmol/L NaCl,2mmol/L EDTA。抗原性检测用商用P24试剂盒(VIRONOSTIKA HIV-1 ANTIGEN KIT)。 2 小鼠被加佐剂免疫 4周龄C57B1/6鼠,在0天、28天以不同剂量(50μg、10μg和1μg)的加佐剂组与无佐剂组分别皮下免疫小鼠,14天后眼眶采血。同时取脾脏分离淋巴细胞并培养在1640液体中,37℃培养4天,收上清。 3 羊抗鼠igg1和igg2a的表达 用P24抗原(200ng/孔)、gp120抗原(200ng/孔)分别包被96孔板,羊抗鼠IgG1和IgG2a使用滴度为1∶103。常规ELISA法检测IgG1和IgG2a。羊抗鼠IgG1和IgG2a得自德国University of Regensburg。 4 病毒释放量检测 抗血清56℃ 30min灭活,按2倍倍比稀释后,与20TCID50HIV 37℃反应1h。HIV毒株得自我国AIDS患者,为B亚型,实验室传代1代,保存1年。将病毒血清混合物接种5×104MT4细胞。37℃ CO2潮湿条件下培养6天。用P24试剂盒检测细胞上清中病毒释放量。中和滴度被检测。 5 细胞因子水平的检测 ENDOGEN试剂盒检测IL-5和IFN-γ水平。此试剂盒由德国University of Regensburg赠送。 结果 1 gag、gag-vlp抑制剂的纯化 表达B、C亚型的gag、gag-V3上清。Western blot结果如图1。gag和gag-V3在gag阳性血清为二抗条件下,在分子量55kD处均有一特异性条带。纯化后的gag、gag-V3 VLP抗原,PAGE胶经考马斯亮蓝染色显示大约75%纯度。P24试剂盒检测OD值大于3.0。 2 抗gaggg3个剂量组的比较表140 我们分别对50μg、10μg和1μg组的gag、gag-V3 VLP与佐剂的关系进行观察。gag免疫鼠血清(1∶40)抗gag IgG 3个剂量组与有无佐剂无关,其差异无显著性(各组P0.1)。而gag-V3免疫鼠血清(1∶40)抗gag IgG 3个剂量组与佐剂有关,其差异有显著性(各组P0.01)(图2)。同时gag-V3免疫鼠血清(1∶40)抗V3 IgG 3个剂量组也与佐剂有关,有显著性差异(各组P=0.01)。 3 抗3ga、igg2a滴度比较 gag和gag-V3 VLP(50μg,佐剂)抗血清中,抗gag及抗V3的IgG1、IgG2a滴度均有升高,而IgG2a稍高于IgG1。同时检测了gag和gag-V3 50μg组抗体的中和能力,gag和gag-V3中和抗体滴度分别为1∶20和1∶40(表1)。 4 细胞培养液gag和il-3a表达的ifn- 本实验对gag和gag-V3(50μg,佐剂)组产生的两因子进行检测,小鼠脾淋巴细胞(gag)产生的IFN-γ为2 400pg/ml,IL-5为400pg/ml;gag-V