hiv双重感染样品中gag和env基因区序列分析.docxVIP

hiv双重感染样品中gag和env基因区序列分析 人免疫缺陷病毒（hiv）可分为两种主要类型：h-1和h-2。它们都可能导致人的免疫缺陷和艾滋病。虽然两种病毒在结构、遗传和生物学性状以及与CD4细胞的结合机制都有很多相似处,但HIV-2感染个体的临床潜伏期较长,无症状期病毒载量和传播效率等都较HIV-1低。HIV-2与HIV-1毒株间的基因差异大于55%,并且抗原性差异也非常显著。已在全球广泛流行的HIV-1毒株根据其基因差异可划分为A-J和O共11种亚型。象HIV-1一样,HIV-2个体毒株间基因序列的差异也较大,目前已证明HIV-2有5种亚型(A-E)存在,各亚型间的序列差异均大于25%。已经分离到的HIV-2型毒株主要为A亚型,少量为B亚型,而C、D和E亚型尚未见全基因序列报道。 上海市卫生检疫局送检了一份血清学上表现为HIV-1和HIV-2共感染的样品,此人曾去过几内亚比绍和塞内加尔,并有多次嫖娼史,我们已对其进行了核酸确认,证实此人确实为HIV-1和HIV-2两种病毒的混合感染者。本文对此HIV-1和HIV-2共感染样品的gag和env基因区分别进行了基因扩增和序列分析,首次阐明了我国出现的HIV-1和HIV-2双重感染样品的毒株特征。 材料和方法 1 抗体阳性样品 上海市卫生检疫局送检的一例HIV-1和HIV-2抗体阳性样品(编号Shh05);对肝素抗凝(20U/ml)的静脉血分离淋巴细胞(PBMC),常规方法提取细胞染色体DNA,-20℃保存。 2 hiv-1和hiv-2的pcr检测 按nested-PCR方法设计合成多对HIV-1和HIV-2特异性PCR引物(表1),分别扩增HIV-1和HIV-2的gag和env基因。 3 hiv-1核酸片段的纯化 第二次PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,切下特异性条带,用Qiagen公司的Qiaex纯化试剂盒按说明书纯化扩增HIV-1核酸片段。 4 荧光标记末端终止物pcr检测 分别使用D3、gagB2、T-j、H2ed和H2gd为测序引物(表1),以提纯的PCR产物为模板,用ABI公司的Big-Dye荧光标记末端终止物循环测序试剂盒在PCR仪上进行测序反应,模板用量约1μg,引物用量为1.6pmol。在ABI公司377型测序分析仪上进行序列测定。 5 序列分析 测得的序列用ABI公司的SeqEdit软件进行编辑、校正,然后使用威斯康星GCG公司软件包完成序列的排列、比较和同源性分析等工作。 结果 1 在env基因区的测序结果 我们使用HIV-2特异性引物扩增Shh05,在gag区得到的片段长度为628pb,极据GenBank Sequence Database的五种亚型的参考毒株,发现我们得到的序列与HIV-2A亚型中的德国株HIV2PEI2KR和UC2较近似,基因离散率分别为8.1%和11.31%。而在env基因区,我们分别得到片段长为360pb和442bp的两段基因片段,经Medline GenBank检索分析发现其仍属HIV-2A亚型,在gp36部分与来自西班牙的AF025336毒株相似,在C2-V3区与来自几内亚比绍的HIV2U05358相似,基因离散率分别为7.05%和13.04%。在两个基因区与其他亚型的基因离散率均大于25%,与HIV-1各亚型毒株间的基因离散率均大于60%。 2 高交流病毒病毒的测序结果 使用HIV-1特异性引物得到gag区和env(C2-V3)区基因序列,长度为628bp和571bp,同样经Medline GenBank检索分析发现,它的两个基因区均与从尼日利亚分离的H92NG083株最相似,属HIV-1的G亚型毒株。基因离散率分别为4.74%和11.23%。 Shh05中HIV-1和HIV-2毒株的gag和env基因区的序列见图1。 3 shh2005毒株亚型的检测 由gag基因和env基因的系统树分析(图2)更加清楚地看到Shh05为HIV-1和HIV-2型毒株共感染样品,并可见其亚型的分布情况。 hiv-2在中国的传播 以上数据显示,我国已出现HIV-1和HIV-2共感染的个体,分别感染的是HIV-1G亚型和HIV-2A亚型毒株。这是首次在我国得到流行于西非的HIV-2毒株序列。Shh05中HIV-2毒株根据gag和env两个基因区的序列特征均可以确定为A亚型HIV-2毒株。已分离到的大部分A亚型HIV-2毒株主要来自塞内加尔和几内亚比绍,该感染者正是西非的塞内加尔和几内亚比绍的回国人员。由此可见,流行病学资料与我们的分子生物学结果相吻合。该感染者携带的HIV-2型毒株为主要流行于非洲的毒株,但在env区的不同片段和gag区分别与GenBank中提供的不同毒株相似,因此尚需对全基因进行研究以确定该毒株的特征以及是否存在基因重组。其