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壁虎多糖对h22肝癌细胞体外抑瘤作用的研究 保护宫是壁虎科动物无瘤无瘤（gelkoswenner）或其他壁虎去除内脏的全部。它是一种传统的冷、热、硬、中药，具有驱风、定痛、溶解粘液和解毒的功效。大量研究报道壁虎有显著的抗肿瘤作用(尤其对消化系统肿瘤)。本课题组前期实验也证实干、鲜壁虎对小鼠H22肝癌具有确切的抑制作用。但壁虎成分十分复杂,究竟是何种成分发挥抗肿瘤作用,目前还不清楚,吴雄志等从守宫中分离得到硫酸守宫多糖,发现该成分可以抑制肝癌细胞BEL-7402的增殖并诱导分化,而对正常肝细胞L-02的生长发育几乎没有影响。对此笔者就壁虎多糖的抗肿瘤作用进行了进一步探讨。 1 材料和方法 1.1 壁虎多糖的制备 壁虎多糖的制备参照吴雄志专利提供的方法。加工过程:干无蹼壁虎1 000 g粉碎为粗粉,置于4 000 mL甲醇中,60℃水浴浸提3 h,2 h各1次,过滤,药渣以8 000 mL蒸馏水90~100℃水浴提取3h,2 h各1次,6 000 mL蒸馏水90~100℃水浴提取1 h1次,过滤,合并3次水提药液,2 000 r/min,20 min离心除去沉淀,浓缩至1 500~2 000 mL,缓缓加入乙醇至30%浓度,边加边搅拌,静置去沉淀,药液再缓缓加乙醇至80%浓度,边加边搅拌,收获沉淀,沉淀用蒸馏水400 mL溶解,滤除不溶物,缓缓加乙醇至80%浓度,边加边搅拌,收取沉淀,用无水乙醇洗涤3次,真空干燥,碾细即得,共得壁虎多糖20.3 g。去离子水配置多糖溶液,体内浓度:200 g/L即为高剂量组,100 g/L为低剂量组。-20℃冰箱备用。氟尿嘧啶注射液(上海旭东海普药业有限公司),批号050510,加入适量的生理盐水中配至3 kg/L。体外实验用的壁虎多糖浓度为100 g/L,体外实验所用多糖及氟尿嘧啶注射液需用0.22μm微孔无菌滤器过滤除菌。RPMI-1640培养液和胎牛血清(Gibco),四甲基偶氮唑盐(MTT),二甲基亚砜(DMSO,Solarbio)。昆明小鼠,体质量(24±1)g,40只,雌雄各半。购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2002-2003。小鼠H22肝癌种鼠购自中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所。 1.2 方法 1.2.1 壁虎糖对p2肝癌细胞的外源性抑制 肿瘤细胞生长抑制率%=(1-实验组A570 nm均值/对照A570 nm均值)×100% 1.2.2 壁虎多糖高、低剂量对小鼠体内细胞指标的影响 H22荷瘤小鼠腹腔肿瘤细胞分别接种于小鼠腹腔连续传代,无菌抽取7 d龄小鼠腹腔肿瘤细胞,加入生理盐水调整细胞悬液中肿瘤细胞浓度至4×109个/L。于每只小鼠右腋下注射0.2 mL肿瘤细胞悬液。24 h后,随机将小鼠分为4组:模型组,西药组,壁虎多糖高、低剂量组。每组10只小鼠,各组间体质量无差异(P0.05)。模型组以生理盐水0.2 mL/d灌胃。西药组以5-Fu(浓度为3 g/L)0.2 mL隔天腹腔注射。多糖组分别以200 g/L,100 g/L灌胃给药,每只小鼠灌胃量为0.2 mL/d。连续给药12 d后,第13天引颈处死小鼠,剥瘤、称质量、计算抑瘤率。 局部实体瘤生长的抑制率=(1-实验组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100%。 对免疫器官的影响引颈处死小鼠后,立即分离胸腺和脾脏,剔除周围结缔组织和脂肪,用滤纸吸干脏器表面水分,称质量,计算脏器指数。 胸腺(脾脏)指数=胸腺(脾脏)质量(mg)/体质量(g)。 统计学处理采用SPSS11.5统计软件,数据采用均数±标准差的形式表示。组间比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。 2 结果 2.1 体外增殖抑制率 壁虎多糖各剂量均可抑制H22细胞的体外增殖,其抑制率最高为79.1%,远远高于西药抑瘤率48.7%。此实验重复3次,重复性较好。见表1。 2.2 内部肿瘤实验 2.2.1 影响b22莲花肿瘤大鼠的体重 实验结果显示,西药组小鼠体质量较对照组明显减轻(P0.05)。多糖组小鼠的体质量较对照组无统计学差异(P0.05)。见表2。 2.2.2 影响p22莲花肿瘤生长 壁虎多糖高剂量组的抑瘤率仅为8.8%,与模型组比较无统计学差异(P0.05)。见表2。 2.2.3 量、脾指数检测 壁虎多糖组与对照组小鼠的胸腺质量、胸腺指数,脾脏质量、脾脏指数均没有明显差异(P0.05)。而西药组胸腺质量、胸腺指数,脾脏质量、脾脏指数较对照组和各壁虎不同部分组明显降低(P0.05)。见表3。 3 壁虎多糖的活性 生物活性多糖是指一类对人体具有某种特殊生物学功能的高分子碳水化合物聚合体。它们广泛存在于自然界中的动物、植物、微生物和海洋生物等所有生物体内,资源丰富。具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用。动物多糖存在和分布极为广