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木蝴蝶提取物槲皮素的含量测定及药动学研究 木槿花是紫嫣科木槿花的成熟种子。作为一种常见的中药，它被记录在《云南南部草本植物》中，有数百年的药物历史。在2010年的《中华人民共和国法典》中。中医理论认为, 木蝴蝶性味苦、甘、凉, 具有清肺利咽止咳、疏肝和胃及生肌之功效, 主治上呼吸道感染、急性支气管炎、慢性咽炎、肺炎后期等症。现代医学研究表明:木蝴蝶具有镇痛、抗炎、抗菌、抗氧化、抑制病毒及肿瘤生长等多种药理作用。药物代谢动力学研究作为药物化学和药理作用之间的桥梁, 有助于进一步揭示黄酮类化合物有效成分发挥药效的作用机制[6,7,8,9,10,11,12,13]。本文尝试采用高效液相色谱检测方式建立高灵敏度并且操作简单的木蝴蝶中槲皮素成分的体内分析方法, 能够适用于低剂量灌胃后木蝴蝶黄酮在大鼠体内的药代动力学研究。 1 仪器和检测方法 Agilent 1200型高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司) ;Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm, 5μm) ;Agilent 1200系列四元泵, DAD1260型检测器;UV-2540型分光光度计 (日本岛津公司) ;AE200型电子天平 (METTLER TOLEDO公司) ;SB-5200DTDN型超声波清洗仪 (昆山超声仪器公司) 。 木蝴蝶提取物由南华大学药理研究中心天然药化室提取制备, 总黄酮含量 (g/g) 为38.5%, 其中槲皮素的含量为19.8%, 提取物批号130725, 对照品槲皮素 (批号:100081-200907) 购自中国药品生物制品检定所, 葡萄糖醛酸苷水解酶 (批号:015k3795, Sigma公司) 。甲醇、乙腈为色谱纯, 水为双蒸水, 其他试剂均为分析纯。 实验动物:SD大鼠10只, 雌雄各半, 体重为 (200±20) g, 南华大学动物实验研究中心, 动物合格证号:SYXK (湘) 2010-0004。 2 方法 2.1 冰醋酸溶液b相 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm, 5μm) ;流动相:乙腈 (A相) -0.1%冰醋酸 (B相) 水溶液, 进行梯度洗脱 (0~0.01 min, A相为12%;0.01~5 min, A相为15%;5~15 min, A相为22%;15~25 min, A相为35%;25~35 min, A相为40%) , 流速:1.00 m L/min, 柱温:30℃, 经全波长扫描确定检测波长为278 nm, 进样量10μL。 2.2 木继续给药、水处理 10只大鼠随机分为2组, 分为正常对照组和给药实验组, 每组5只, 实验前禁食12 h, 自由饮水。实验组灌胃给药10 mg/kg木蝴蝶提取物, 正常组给予等体积的生理盐水。给药前 (0 min) 和给药后10、20、30、60、90、120、180、240、360、480 min经大鼠眼眶取血约0.5 m L, 置肝素化离心管中, 相对离心力为2500 g, 离心15 min, 精密吸取上层血浆200μL, 混匀后置-20℃冰箱保存待测。 2.3 丙酮溶液的制备 37℃水浴解冻样品后, 加入980 U/m L葡萄糖醛酸苷水解酶80μL, 37℃振荡水浴下水解30 min加入丙酮600μL终止反应。涡旋2 min后, 相对离心力为6700 g, 离心10 min。取上清液850μL, 50℃下氮气吹干, 加入流动相85μL溶解, 相对离心力为10000 g, 离心10 min。取上清液进样分析。 3 结果 3.1 方法学评价 3.1.1 血浆对照品和血浆生物样品的制备 取正常组大鼠血浆按“2.3”项下方法处理后进样分析, 得到空白血浆色谱图见图1-A;另取一份空白血浆, 加入槲皮素对照品, 溶于流动相后进样分析, 得到血浆对照品的图谱见图1-B;抽取给药10 mg/kg后10 min的血浆生物样品1份。按“2.3项”下方法处理后进样分析, 得到生物样品图见图1-C;由图可见在本文分析法下, 空白血浆的内源性物质不干扰槲皮素的测定, 且给药后生物样品和对照品在相同位置出峰, 说明该方法对大鼠血浆中槲皮素的分析有专属性。 3.1.2 对照品血浆的制备 精密称取槲皮素1.0 mg以甲醇定容至10 m L作为对照品贮备液。以流动相稀释储备液100倍, 配置1.0μg/m L的对照品溶液。在450μL空白大鼠血浆中精密加入对照品溶液50μL, 再以空白血浆逐级稀释, 配制成0.5、1.0、5.0、10.0、50.0μg/m L系列浓度的对照品血浆。按照“2.3”项下方法处理后进样分析。以峰面积Y为纵坐标, 对照品浓度X为横坐标, 计算得到槲皮素回归方程分别为:Y=13.86X+0.96