NY_T 2186.4-2012微生物农药毒理学试验准则第4部分：细胞培养试验.pdf

ICS 65.020.01B 17NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2186.4-2012微生物农药毒理学试验准则第4部分：细胞培养试验Microbial pesticide toxicological test guidelines--Part 4 : Cell culture study2012-06-06 发布2012-09-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2186.4—2012前 言NY/T2186《微生物农药毒理学试验准则》分为以下几部分：第1部分：急性经口毒性/致病性试验；-第2部分：急性经呼吸道毒性/致病性试验；-第3部分：急性注射毒性/致病性试验；-第4部分：细胞培养试验；-第5部分：亚慢性毒性/致病性试验；-第6部分：繁殖/生育影响试验。本部分为《微生物农药毒理学试验准则》的第4部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位：农业部农药检定所。本部分主要起草人：张丽英、陶传江、李敏、孟宇晰、闫艺舟、叶纪明。I NY/T2186.4—2012微生物农药毒理学试验准则第4部分：细胞培养试验1范围本部分规定了细胞培养试验的基本原则、方法和要求。本部分适用于为微生物农药登记而进行的细胞培养试验。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1病毒毒性viraltoxicity病毒损伤或破坏宿主细胞的能力，不一定同时发生病毒的复制或感染。2. 2病毒感染性viralinfectivity病毒基因整合到宿主细胞基因组中的能力,或病毒基因在宿主细胞中的表达能力。2.3转化transformation病毒核酸引起的宿主细胞表型发生可检测的变化。2. 4最佳感染形态mostinfectiousform（MIF）病毒对易感细胞或机体发挥最大感染作用时的形态或制备物。对于非包涵体病毒，最佳感染形态为纯化的病毒，或从感染宿主中得到的纯化组织；对于包涵体病毒（如杆状病毒、细胞质型多角体病毒、昆虫痘病毒等），细胞培养或机体注射的最佳感染形态是从细胞培养基或感染的血淋巴中获得的胞外病毒。通过自然途径（饲喂）感染易感昆虫宿主的最佳感染形态是病毒包涵体。2. 5细胞病变效应cytopathiceffects（CPE)病毒感染引起的宿主细胞的任何损伤或破坏，包括形态学和生物化学方面的，如细胞生长、贴壁、形态、核大小与形状、细胞生长过程（如大分子物质合成)等。3试验目的了解病毒类微生物农药感染哺乳动物细胞，在哺乳动物细胞内复制、转化以及产生毒性的相关信息。4试验方法4.1受试物使用最纯的MIF病毒进行试验。昆虫病毒的制备物不应含有昆虫血淋巴，除非已经确认血淋巴对所用的细胞培养物没有毒性。应在最适宜的宿主体系中（如细胞培养物，若不可能，则用宿主机体），采用最敏感的测试方法，进行接种体的滴定检测。在用模型体系进行试验时，对可用蚀斑法检测的病毒，1 NY/T2186.4—2012要求每个细胞最少用5个蚀斑形成单位（PFU)进行感染；对无法用蚀斑法检测的病毒，要求每个细胞用7XLDso单位进行感染。如果达不到上述要求，必须提供相应的理由。4.2细胞推荐使用下列细胞：人类细胞系（如WI38）、原代培养细胞（如包皮细胞）、灵长类动物传代细胞系（如猴CV-1或BSC-1)和原代叙利亚地鼠胚胎（(SHE)细胞（用于细胞转化试验）。评价某些特殊病毒本身具有的潜在效应，可选用其他细胞系，但需提供理由和依据。4.3毒性评价每个细胞系都要分别进行成斑率试验。方法为：选用30个平皿，分别接入约200个细胞，37℃培养24h。取10Ⅲ加入约1.0×106单位病毒，另取10Ⅲ加入相应的脊椎动物细胞培养液，其余10Ⅲ加人等体积无脊椎动物培养液。处理1h后，所有的培养血都用相应的脊椎动物细胞培养液继续培养，至未处理对照组的细胞集落至少为25个细胞/集落时停止。对所有培养血进行固定、染色，计数集落数。4.4感染性评价4.4.1培养生长中未汇合的细胞(25cm²培养血含约2.0×105个细胞)暴露于1.0×106单位病毒农药。对照组包括未处理的未汇合细胞对照和暴露于无病毒接种液的未汇合细胞对照。接种后7d和14d，进行细胞传代。4.4.2接种后，每天观察细胞病变情况，连续21d。4.4.3接种后第1d、2d、5d、7d、14d、21d,检测培养物中病毒含量：a）全部细胞或2.0×105个细胞的培养物，分别用三份平行样，检测病毒抗原和核酸；b)用适宜的易感宿主模型体系，检测从复制培养物得到的培养液中感染性病毒的含量。4.4.4病毒归宿及病毒蛋白质和核酸含量的检测方法：a）蛋白质检测：推荐酶联免疫吸附法（ELISA）、斑点免疫吸附法和蛋白印迹免疫分析法（Western转膜）或其他类似的蛋白质检测