不同的冻存方法对I型糖尿病患者胰岛抗原特异性T细胞反应的影响.docVIP

2013,38(2) http:// 2013,38(2) ; http://xbyx [ Cent South Univ(Med Sci) 169 DOI:10.3969/jissn.1672-7347.2013.02.010 /xbwk/fileup/PDF/201302169.pdf 不同的冻存方法对 I 型糖尿病患者胰岛抗原特异性 T 细胞反应的影响 杨琳，超晨，唐维，王臻，俞海波，崔秋燕，周智广 (中南大学湘雅二医完内分泌科，中南大学糖尿病中心，中南大学代谢内分泌研究所， 糖尿病免疫学教育部重点实验室，长沙410011) [摘要]目的： 明确何种冻存方案更利于保持1型糖尿病患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs) 对胰岛抗原特异性的T 细胞反应，更接近于新鲜细胞的状态。 方法： 本研究系国际免疫学协会-T 细胞 工作组 (IDS-TCW) 牵头的国际标准化研究 Freezing StudyI。 中南大学糖尿病中心选取5例新发的TID 患者和年龄、性 别相匹配的5例正常对照。所有对象新鲜分离的PBMCs 分为3份， 一份进行亚型细胞的流式细胞分析和酶联免疫斑 点实验 (enzyme linked immunospot assay,ELISPOT), 另两等份分别采用低温和室温冻存方案冻存；1个月后分别按低温 和室温方案复苏，以台盼蓝染色判定细胞活力；并行流式细胞分析术和 ELISPOT 检测。 ELISPOT 中4种抗原[包括 人GAD65、 内对照、 Pediacel(巴斯德五合一疫苗)和 PMA] 均由 IDS-TCW 中心化实验室盲法标记，盲法测定。以新鲜 PBMCs 为参照，比较两种冻存方案下 PBMCs 的复苏率和活力、各亚型细胞比例和ELISPOT 检测结果。 结果： 1)室温 冻存下的 PBMCs 复苏率和细胞活力均略高于低温冻存方案，但二者差异无统计学意义(分别为61.2% vs 60.1%,77.5% vs74.9%;P0.05);2)相比新鲜细胞，两种冻存方案均会造成一定程度的单核细胞的损失[(3.2±1.1)%(低温)和(3.0±0.9)% (室温)vs(7.0±1.1)%(新鲜); P0.05]; 而 CD4T,CD8T,B 细胞，NK 细胞和NKT 细胞比例均无明显变化(P0.05); 3) ELISPOT 检测结果显示：对多克隆刺激物PMA 诱发的T 细胞分泌IFN- γ的反应，在新鲜和冻存复苏细胞间无明显差异； 记忆性抗原 Pediacel和胰岛抗原 GAD65 刺激下的特异性T 细胞反应在冻存复苏细胞均明显差于新鲜细胞， TID 患者新 鲜细胞的GAD 特异性T 细胞反应的SI为5.1,均高于低温(1.3)和室温(1.4)冻存复苏的刺激指数(SI)( 均 P0.05); 而 且仅新鲜细胞的GAD- 反应性T 细胞的SI和斑点数均明显高于正常对照(5.1vs 0.9和8.1vs 0.1,P0.05), 而两种方案 下的冻存细胞的SI在患者和对照未发现差异。结论：需要开展更多的研究，在TID 患者中鉴定出一种更接近于新鲜 PBMCs 反应的冻存方案和T 细胞测定方法。 [关键词] 1型糖尿病； T 细胞；冻存方案；酶联免疫斑点法 Effect of cryopreservation method on islets specific T cell responses in type I diabetic patient YANG Lin, CHAO Chen, TANG Wei, WANG Zhen, YU Haibo, CUI Qiuyan, ZHOU Zhiguang (Department ofEndocrinology, Second Xiangya Hospital, Central South University; Diabetes Center, Central South University; Institute ofMetabolism and Endocrinology, Central South University; Key Laboratory of Diabetes Immunology,Ministry ofEducation, Changsha 410011, China) 收稿日期(Date ofr