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细胞破碎方法对释放乙醛脱氢酶的影响 乙醇在人体的代谢主要依赖于两个酶中的酶，一个是乙醇脱氢酶（adh），另一个是乙醛脱氢酶（adh）。前者使乙醇转化为乙醛, 后者使乙醛进一步转化为乙酸, 最终分解为二氧化碳和水。人体中, 一般都存在前一种酶, 而且数量基本是相等的。但缺少后一种酶的人就比较多, ALDH的缺少, 使乙醇不能被完全分解为水和二氧化碳, 而是以乙醛的形式继续留在体内。有资料表明, 乙醛在人体内的过度堆积是醉酒的主要原因。目前, ALDH主要是从动物的肝脏、胰腺或肝细胞线粒体中分离提取, 但其资源有限且价格昂贵, 因此很难大规模生产。为了拓展ALDH的来源, 国内外科学工作者开始探索从微生物细胞中提取ALDH, 国外在此方面已做了大量的工作, 并得到活性较高的ALDH。国内还没有见到从微生物细胞中提取ALDH的报道。因此, 通过微生物的发酵、分离纯化ALDH, 具有很大的市场前景。从酵母中分离提纯ALDH是一个较为复杂的过程, ALDH为胞内产物, 大部分存在于线粒体中, 其他存在于胞液中, 首先必须将细胞破壁, 使产物得以释放, 才能进一步提取。成熟的酵母菌细胞壁较厚, 不易被破碎, 而且ALDH对温度及酸碱度很敏感, 容易失活。因此寻找一种既能高效破碎酵母细胞, 又能有效维持ALDH稳定性的方法是非常必要的。本文对搅拌、珠磨、高压细胞破碎仪和高压破碎仪破碎酵母细胞释放ALDH进行了较为系统的研究, 为从酵母中分离提取ALDH作准备。 1 材料和方法 1.1 evisiaeacy2c2模型 菌种酿酒酵母AY92022 (Saccharomyces cerevisiae AY92022) ;斜面培养基蛋白胨2%, 酵母膏1%, 葡萄糖2%, 琼脂2%, p H6.0;液体培养基蛋白胨0.5%, 酵母膏0.3%, 麦芽汁0.3%, p H5.5。 1.2 离心液处理细胞培养液制备 将酵母菌种接种于斜面培养基中, 在30℃恒温箱中培养12h后, 再将菌种接种于液体培养基中, 于30℃恒温摇床中培养17h。取细胞培养液离心 (6000r/min, 5min) , 弃去上清液得到沉淀, 用蒸馏水洗涤2~3次。取菌体细胞, 加入含有5%50mmol/L p H8.0的Tris-Cl、0.2%1mmol/L的EDTA、2%100mmol/L的Na Cl的缓冲溶液, 用四种不同的方法进行细胞破碎, 离心后取上清液测蛋白质含量和乙醛脱氢酶 (ALDH) 的活力。 1.3 细胞破碎法 1.3.1 提取一段时间 水浴锅中保温2h, 不断搅拌, 再于室温中不断搅拌提取一段时间。将溶有菌体的缓冲溶液在37℃水浴锅中保温2h, 不断搅拌, 再于室温中不断搅拌提取一段时间。 1.3.2 振荡悬液制备 取溶有菌体的缓冲溶液500μL, 加入用酸洗过的玻璃珠至其总体积为1.25m L, 在旋涡混合仪上剧烈振荡悬液1min数次, 每次间歇期间将悬液置于冰浴中冷却1min。 1.3.3 高压细胞破碎法 1.3.4 高压破碎法 1.4 蛋白质含量测定 采用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。 1.5 乙醇脱氢酶aldh活性测定[5.8] 在340nm处测定ALDH催化乙醛脱氢生成乙酸所用的酶量。定义每分钟A340nm增加0.001为1个活力单位 (U) 。 2 结果与讨论 2.1 时酶活力测定 图1表示搅拌粗提对蛋白质含量及ALDH活性的影响, 室温搅拌3h时酶活力最大;在0~3h时, 蛋白质含量随时间的增大而增大;在3h以后, 蛋白质含量已增加不多。由于ALDH大部分存在于酵母细胞的线粒体中, 搅拌粗提时不能充分释放到胞外, 从而酶的活力很低。 2.2 破碎离心后上清液蛋白质含量的变化 在含有酵母菌体的缓冲液中加入酸洗过的玻璃珠, 置于旋涡混合仪上剧烈振荡数次, 每次振荡1min后间歇1min, 间歇期间将悬液放在冰浴中冷却, 防止温度过高使ALDH失活。由图2可以看出, 破碎离心后上清液中蛋白质含量随时间的增加而增大, 振荡40min时, 蛋白质含量将增加不多。ALDH活力随振荡时间先是增大后是减小, 在30min时达到最大。 2.3 酵母细胞的制备 采用Niro Soavi提供Panda 2K实验室级高压细胞破碎仪来破碎酵母细胞。它可以在高达1500bar的压力下连续处理各种粘度的物料。它的残留量小, 每分钟处理量为165m L。这种高压细胞破碎仪能够破碎微生物、动物细胞、植物细胞及组织, 它能连续、稳定、持久地工作, 有一定的破碎效果。 2.3.1 输出压力对其破碎的影响 在固定循环次数为2时, 考察不同压力下的破碎情况, 结果如图3所示。从图3可知, 高压细胞破碎仪的压力对破碎效果有很大影响, 随输出压力的增大, 破碎的作用增强, 但压