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基于微流控技术的蛋白质结晶研究进展 蛋白质是所有生命活动的基础。分析蛋白质的分子结构有助于理解其功能和分子作用的机制。这对于有关生命周期和疾病的诊断和治疗非常重要。1.x射线衍射技术是目前最重要、最可靠的蛋白质结构测定技术，也是当前结构生物学研究的主要平台技术。由于蛋白质在结晶过程中受到蛋白质纯度、添加剂、沉淀剂类型、离子强度、ph值和温度等因素的影响，结晶过程非常复杂。目前，纯理论无法成功预测蛋白质结晶的最佳条件。因此，如何获得足够的演绎分辨率的蛋白质晶体是贯穿结构的主要问题。2.4现在，大规模的结晶条件筛选仍然是获得高质量蛋白质晶体的主要手段。然而，传统的蛋白质结晶筛选技术样品含量高，研究成本高，难以广泛应用于低表达蛋白质的结构生物学研究。一些低发现的蛋白质通常在生命活动中发挥着极其重要的作用。 生命科学研究的重要突破往往依赖于新技术的发展和新仪器的研发. 为了降低蛋白质结晶筛选的样品消耗量,仪器制造商相继开展了高通量蛋白质结晶筛选系统的微型化研究,推出了一系列纳升级的结晶筛选机器人,其中具有代表性的有英国Douglas公司研制的Oryx-nano系列结晶机器人、美国ArtRobbins公司研制的Phoenix机器人及英国TTP Lab Tech公司研制的Mosquito系列机器人等［6 ～ 8］. 采用这些筛选系统可使单个筛选反应的蛋白质消耗量降低到50 ~ 200 n L,比常规筛选系统降低了20 ~ 100倍,同时也有效减少了研究成本和时间. 然而,对于膜蛋白等一些难以表达纯化的珍稀蛋白质样品,此类仪器的蛋白质耗样量仍然过高,难以满足结构生物学研究的需要. 进一步降低蛋白质结晶筛选耗样量的主要技术难点在于: (1) 由于蛋白质和沉淀剂溶液具有高黏度和较低的界面张力,现有的超微量液体处理方法(喷墨打印和固体缝针接触点样)难以在皮升到纳升级范围内进行可靠的液体量取和转移; (2) 随着液体体积的缩小,比表面积增加,蒸发效应显著增加(如在常规实验室条件下,一个数皮升的水滴会数秒内即可完全挥发); (3) 微体系下液体的比表面积显著增加,生物分子在水/气界面和水/固界面上的分子自组装或非特异性吸附［9］易引起分子失活［10］、损失以及交叉污染,从而可能导致筛选结果的假阳性或者假阴性. 微流控技术是现今国际高新科技前沿领域之一. 它采用微机电技术加工出具有微米尺度通道网络结构的芯片,通过对芯片中皮升至纳升级微流体的操纵和控制,实现生物医学和化学实验室的集成化分析检测功能. 在微流控技术发展的早期就出现了在芯片上进行蛋白质结晶的成功案例［11，12］. 然而, 由于早期的微流控芯片多采用硬质的半导体硅材料,在加工技术和流体驱动方法上均受到较大限制, 因此相关研究进展缓慢［8］. 近年来,采用基于聚二甲基硅氧烷( PDMS) 薄膜的微泵微阀技术、液滴(Droplet)技术、滑动芯片(Slip Chip)以及液滴实验室(Drop Lab) 技术的微流控系统在蛋白质结晶及其筛选研究中的应用取得了快速发展［13］. 微流控技术已逐渐成为蛋白质结晶微型化研究最有潜力的发展方向之一. 利用微流控技术进行蛋白质结晶的主要优势有: (1) 微流控系统对超微量液体的操控能力可将蛋白质结晶的样品消耗量降低至几个纳升甚至是皮升级水平,从而使许多珍稀蛋白质的结构生物学研究成为可能; (2) 微体系下一些特殊的物理和化学效应对蛋白质晶体的成核和生长具有良好的促进作用(如微体系下重力导致的溶液内部环流效应显著降低,蛋白质晶体的生长堆积较为整齐,可提高晶体结构鉴定的分辨率); (3) 微流控技术具有通道网络大规模集成和溶液操纵自动化的特点, 可大幅减少复杂繁琐的手动液体操作,缩短实验时间,从而有效提高筛选的通量［14］. 国内外现有的关于微流控蛋白质结晶的综述文章分别着重介绍了PDMS薄膜微泵微阀［13，15 ～ 17］及液滴［13，16 ～ 19］等技术在蛋白质结晶方法上的相关应用,而对于微流控蛋白质结晶技术实现的细节方面介绍较少,对于非微流控研究领域的科研人员,不易理解其具体的原理和方法. 本研究组在微流控芯片领域进行了较长时间的研究,利用微流控技术进行了蛋白质结晶条件筛选方面的研究,发展了基于连续流液滴［20］及液滴实验室(Drop Lab)［21］等相关技术的蛋白质结晶筛选方法. 本文以我们近几年的研究工作为基础,从微流控技术角度出发,综述基于微流控技术的蛋白质结晶筛选方法,并对各类技术的优缺点及其应用进行了详细评述. 1 基于pdms的气动微阀 微量流体的控制是微流控技术的核心操作,而蛋白质结晶筛选所涉及的液体量取、进样、混合及孵育等过程均需要多样化的流体控制技术. 2000年,Quake等［22］首次采用多层软光刻技术制作了PDMS气动微阀,该