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一种微型角毛藻的分离鉴定 1 浮游植物的种类、生物学和浮游学 小型浮游植物（粒度为2.20m）是海洋环境上的主要初级生产者，占海洋初始工业的很大一部分。特别是在盲水域，小型浮游植物可占初始工业的80%以上，颗粒层结构上的小型浮游植物对初始工业的贡献相对较大。 角毛藻属于硅藻门(Bacillariophyta)、中心纲(Centriae)、盒形藻目(Biddulphiales)、角毛藻科(Chaetoceroceae)、角毛藻属(Chaetoceros)。培养种类有牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、钙质角毛藻[Chaetoceros calcitrans(Paulsen)Takana]、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)等,它们都是生长在海中的浮游微藻,细胞小,细胞壁薄,大多数是单个细胞,也有数个细胞集成群体的。壳面呈椭圆形或圆形,中间略突起,少数较平坦。壳环面呈长方形至四角形。壳环带不明显,角毛细而长,末端尖。培养过程中细胞形态常有变化,细胞中间膨大,角毛缩短或消失,繁殖方式一般为无性的二分裂繁殖。环境不良时可形成休眠孢子。角毛藻属耐高温种类,适合在夏季培养,是双壳贝类,海参,海胆甲壳类等幼体的优质饵料,角毛藻作为一种经济藻类有十分广阔的前景。 微型角毛藻是指粒径为2 ~ 20 μm的角毛藻属的藻类,目前对其系统的研究较少,研究较多的主要是作为饵料的种类,如牟氏角毛藻和纤细角毛藻,它们是对虾、海胆、海参等养殖品种的优质饵料。 以前对浮游植物的分类学研究主要依靠形态学手段,但形态学的鉴定有诸多不足之处。首先,形态学的鉴定需要有经验丰富的专业工作人员,而且工作量大;其次,生物的形态学特征有时会因环境的变化而改变,形态学鉴定无法解决这一难题。分子生物学分类方法以核酸序列的差异为分类依据,由于核酸序列在遗传上的稳定性要大大高于形态学特征,避免了环境因素造成的细微外观差异引起的错误判断,解决了依赖主观判断而存在的困扰,因而在近年来得到了广泛的应用。 本实验从天然海水中分离到一种微型硅藻,借助光镜和电镜技术,初步判断为角毛藻,进一步利用5.8SrDNA-ITS和18SrDNA序列的扩增和分析,对这株藻进行了分类鉴定。 2 实验材料和方法 2.1 材料表面 2.1.1 有限稀释法 本实验所用藻株C.sp.qd分离于青岛太平角海域(36°02′N,120°20′E)。分离方法为96孔板有限稀释法。藻株培养于不加硅的F/2培养基上,培养温度为24 ℃,明暗时间比为12h∶12h,光照度为1 300 lx。 2.1.2 dnapurificicici本体系统和试剂 凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit)购自TakaRa公司,Taq酶等PCR试剂购自MBI公司,其他试剂为分析纯。 2.2 方法 2.2.1 微生物滤膜富集 使用96孔板分离培养的方法,从天然海水中纯化微藻,利用500目筛绢和0.8 μm微孔滤膜富集细胞大小为1~20 μm的微藻,并在微藻放入f/2培养基中培养至适宜浓度。血球计数板计算密度,根据密度将藻液稀释到每200 μL含有1~2个单藻,并把它们分到96孔板中,定期镜检,直到100倍油镜下观察藻细胞形态一致即纯化成功。 2.2.2 有明胶膜的制备 用1.5 mL EP管取1 mL处于对数生长期的藻细胞,按1 000 r/min离心10 min收集藻体,加1 ml 1%戊二醛固定2~3 h,按1 000 r/m离心10 min,用0.1 mol/dm3的磷酸缓冲液漂洗3次,然后依次用30%,50%,70%,90%,100%的乙醇进行逐级脱水,用吸管将含有样品的乙醇溶液滴在有明胶膜的盖玻片上,可防止细胞被冲走,用临界点干燥法干燥,用离子溅射镀膜法镀膜。 2.2.3 藻体水分含量测定 用1.5 mL EP管取1 mL处于对数生长期的藻细胞,按1 000 r/min离心收集藻体,加500 μL浓盐酸,水浴煮沸20~30 min,加高锰酸钾溶液少许,静置24 h,加草酸褪色,水洗至中性,用铜网直接蘸取少许样品,静置片刻,用吸水纸吸去多余的水分,干燥后观察。 1.2.4 藻细胞研磨液 取角毛藻对数生长期的藻细胞3×106个/mL,5 000 r/min离心5 min ,收集藻细胞。将藻细胞于液氮中研磨后转入1.5 mL离心管。使用TIANGEN 植物总DNA试剂盒(TIANGEN Biotech Beijing)提取基因组DNA,操作方法严格按照试剂盒说明书进行。 2.2.5 pcr扩增产物 根据NCBI数据库中硅藻18S序列设计引物,PCR扩增18S序列;根据已测序的18S序列设计ITS-5.8SrDNA的正向引物,根据相关硅藻的ITS序列设计反向引物。