山茱萸CoHMGR基因的亚细胞定位和表达分析.docxVIP

? ? 山茱萸CoHMGR基因的亚细胞定位和表达分析 ? ? 王瑶瑶，凡贞洁，李 炯，刘晓冉，王 龙，张佳琪，胥华伟，侯小改*，侯典云* 山茱萸基因的亚细胞定位和表达分析 王瑶瑶1, 2，凡贞洁1, 2，李 炯3，刘晓冉1, 2，王 龙1, 2，张佳琪1, 2，胥华伟1, 2，侯小改1, 2*，侯典云1, 2* 1. 河南科技大学农学院，河南 洛阳 471023 2. 洛阳市道地药材繁育与创新利用工程技术研究中心，河南 洛阳 471023 3. 河南省农业农村厅中药材生产技术服务中心，河南 郑州 450000 研究山茱萸基因编码蛋白质的亚细胞定位以及不同浓度的外源激素对基因表达和活性成分含量的影响。农杆菌菌液侵染烟草叶片，激光共聚焦倒置显微镜观察CoHMGR蛋白的亚细胞定位。不同浓度的茉莉酸甲酯和乙烯利喷施山茱萸2年生幼苗，实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）测定不同时期基因表达水平，高效液相色谱（HPLC）检测莫诺苷、马钱苷含量。激光共聚焦显微镜下观察到CoHMGR蛋白定位于内质网中。qPCR和HPLC结果显示200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利对目的基因表达水平和活性成分含量都有正向诱导效应。CoHMGR蛋白定位于内质网，外源喷施200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利能显著提高基因表达量和莫诺苷、马钱苷含量，为深入解析基因功能奠定基础。 山茱萸；；亚细胞定位；莫诺苷；马钱苷；表达分析 山茱萸Sieb. et Zucc.为多年生落叶乔木或灌木，其成熟去核干燥后的果肉入药，是多种中成药的主要成分，在河南、山西、甘肃、山东和浙江等省份都广有分布[1]。山茱萸含有环烯醚萜苷类、黄酮类、三萜类、多糖和鞣质等多种活性物质，其中，环烯醚萜类化合物是山茱萸的特征性物质[2]。山茱萸环烯醚萜化合物种类众多，具有代表性的是莫诺苷和马钱苷，越来越多山茱萸环烯醚萜类物质也在不断的被发掘[3]。现代医学研究表明，山茱萸具有多种药理功能，如从山茱萸中提取的总萜类物质可以有效降低血糖；山茱萸的环烯醚萜总苷既可以降低血糖和调节血脂，又能够起到抑制血栓形成的作用[4-6]。目前关于山茱萸的研究主要集中在活性成分的挖掘和药理作用的探究等方面，有关山茱萸萜类合成途径的研究十分有限，因此从分子生物学的角度解析山茱萸萜类生物合成途径关键基因的功能显得非常重要。 3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase，HMGR）催化萜类生物合成甲羟戊酸途径（mevalonic acid，MVA）中的第3步反应，HMGR为该途径中的第1个限速酶，是调控萜类次生代谢产物合成的关键酶[7]。近年来，越来越多来自不同植物的基因被克隆，并对其功能进行了初步验证[8]。徐晓腾等[9]克隆并分析了人参皂苷合成过程中的重要酶，从多个数据库进行了注释分析；郭思远等[10]克隆了东北雷公藤基因，并对该基因做出了生物信息学分析，预测基因编码的蛋白质位于内质网中。 本实验基于课题组前期获得的山茱萸转录组数据＞c100572_g1[11]，构建表达载体，根据基因编码蛋白在烟草叶片细胞中的荧光位置判断CoHMGR蛋白的亚细胞定位，同时探究了喷施不同浓度茉莉酸甲酯和乙烯利对山茱萸基因的表达模式及其活性成分含量的影响，为阐明山茱萸萜类物质分子合成途径提供参考。 1 材料与仪器 1.1 材料 山茱萸2年生幼苗种植于河南科技大学农学院试验田中，由河南科技大学戴攀峰副教授鉴定为山茱萸Sieb. et Zucc.，种植期间水肥管理一致，选取生长状态基本相同的植株作为外源激素喷施对象，喷施完成后摘取叶片为实验材料。选取本氏烟草为亚细胞定位的材料。 1.2 仪器 FV3000型激光扫描共聚焦显微镜（Olympus公司），5415 R型高速冷冻离心机（Eppendorf公司），紫外-可见光分光光度计来源，JY04S-3D型凝胶成像分析系统（君意电泳公司）等。 2 方法 2.1 山茱萸RNA提取和反转录 称取山茱萸叶片70～80 mg，装入标记好的灭菌1.5 mL离心管中，球磨仪研磨叶片成粉末，按照诺贝莱RNA提取试剂盒步骤提取山茱萸叶片总RNA，跑胶确认其完整度后，用微量分光光度计测定浓度，再使用艾德莱反转录试剂盒根据需要得到一部分用于PCR扩增的cDNA，一部分用于实时荧光定量PCR实验的cDNA，标记好保存于?20 ℃冰箱备用。 2.2 亚细胞定位表达载体构建 山茱萸基因开放阅读框全长1731 bp，共编码576个氨基酸。使用Primer Premier5.0软件设计引物，去掉开放阅读框的终止子，在终止子这端添加酶切位点，-F：5’-ATGGAC