肉制品中大肠菌群的检验—第二法大肠菌群平板计数法.pptx

大肠菌群平板计数法 样品的采集和处理一设备和材料二培养基和试剂三 目录页 大肠菌群平板计数检样程序四 大肠菌群平板计数检样操作步骤五 一、样品的采集和处理1. 样品的采样原则和采样方案 样品的采样原则和采样方案和大肠菌群MPN计数法一样，都按照国家食品微生物学检验总则GB4789.1—2016中的相关规定去实施。2. 样品的采集和处理 样品的采集和处理方式与大肠菌群MPN计数法一样，都按照国家食品微生物学检验肉与肉制品检验GB/T 4789.17—2003中的相关规定去实施。大肠菌群平板计数法 二、设备和材料大肠菌群平板计数法除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、天平、菌落计数器、无菌培养皿、菌落计数器、pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸等。 三、培养基和试剂大肠菌群平板计数法 煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉汤 结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA) 无菌磷酸盐缓冲液 无菌生理盐水 1mol/LNaOH 溶液 1mol/LHCl溶液 36℃±1℃培养18h~24h选择15~150平板计数典型和可疑菌落挑选10个典型菌落接种到BGLB典型菌落为紫红色周围有红色胆盐沉淀环，直径为0.5mm四、大肠菌群平板计数检样程序 五、大肠菌群平板计数检样操作步骤大肠菌群平板计数法1. 样品的稀释 同大肠菌群MPN计数法中的样品稀释操作。2. 样品的接种和培养2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。2.2 及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。 五、大肠菌群平板计数检样操作步骤大肠菌群平板计数法3. 平板菌落数的选择 选取菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU 的记录具体菌落数。4. 证实试验 从VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。 五、大肠菌群平板计数检样操作步骤大肠菌群平板计数法5. 大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。 例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA 平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。