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? ? 黑花生原花青素优化提取条件的研究 ? ? 刘贵忠 （1.德州学院 物理与电子信息学院；2.山东省功能大分子生物物理重点实验室，山东 德州 253023） 原花青素由儿茶素、表儿茶素、没食子酸三种单体及其衍生物聚合而成，可形成二聚体、三聚体、四聚体乃至十聚体.通常将二至四聚体称为低聚体，五聚体以上称为高聚体[1].原花青素为双黄酮衍生物的天然多酚、生物类黄酮化合物，广泛存在于生物组织中，主要功能为抗氧化、清除自由基，是活性很强的天然产物，有抗腹泻、抗溃疡、抗疲劳、防癌抗癌、抗突变、防辐射、促进毛发生长等多重疗效，可预防自由基引起的心脏病、关节炎等多种疾病，因而在保健食品、化妆品等领域广泛应用[2-6].由于不同来源的原花青素组分差别很大，螯合剂的结构不同，二者之间的作用方式、作用强度不同，因而提取条件也不同，很难找到一种普遍适用的提取方法[7-17]. 为研究黑花生原花青素的提取方法优化，采用有机溶剂法提取黑花生原花青素，在有机溶剂浓度、水浴温度、水浴时间、料液比四个影响因素下，利用正交试验方法确定最佳提取条件. 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 紫外分光光度计（BLUE-Star，北京莱博泰科）,旋转蒸发仪（RE-52AA,上海亚荣）,电子天平（梅特勒），粉碎机(TYSP-200)，恒温水浴锅，真空泵，冷冻干燥箱等.儿茶素标准品（合肥博美生物科技有限责任公司），无水乙醇，浓盐酸，香草醛（上海生工），石油醚（上海生工），均为分析纯，黑花生（黑丰，山东省农科院资源中心）. 1.2 方法 采用正交试验法研究四种提取因素对黑花生原花青素提取的影响. 1.2.1 儿茶素含量标准曲线 溶液配制 称取儿茶素标准品20mg，用超纯水溶解，定容至10mL容量瓶中，作为儿茶素标准品溶液.取2g香草醛溶于50mL甲醇（均为上海生工,分析纯），并加入25mL浓盐酸，配成香草醛-盐酸溶液. 标准曲线 在10mL容量瓶中分别加入儿茶素标准品溶液 0、0.5、1、1.5、2、2.5mL，用超纯水定容，依次移取 1mL加入9mL香草醛-盐酸溶液，避光反应20min，在500nm处测定吸光值[19-22]，并以儿茶素质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，用origin8.0软件作标准曲线如图1.标准曲线拟合方程为 图1 原花青素标准曲线 1.2.2 黑花生中原花青素的提取 黑花生种子预处理:黑花生种子剥离内衣、烘干，于粉碎机中粉碎，用1:3料液比的石油醚脱脂48h，抽滤，将滤渣烘干备用. 原花青素的提取:称取一定量的处理过的花生于容器中，在一定的溶剂浓度、料液比、水浴温度、水浴时间下酸化处理，将所得浸提液抽滤，滤液于干燥箱烘干，加超纯水溶解，定容至10mL容量瓶中，得到原花青素粗体液，取1mL原花青素粗提液加入9mL香草醛-盐酸溶液，避光反应20min，取3mL反应后溶液，用紫外-可见分光光度计测500nm处吸光度，按标准曲线拟合方程（1）计算样品原花青素含量[20-22]. 1.3 工艺优化试验说明 根据彭芳刚方法[15]，以原花青素提取量为考察标准，以乙醇浓度、料液比、水浴时间和水浴温度为影响因素，先对各因素进行单因素试验，在此基础上对4因素正交试验，对试验结果采用SPSS（Statistical Product and Service Solutions）13.0统计软件进行分析[23-26]. 2 结果与分析 2.1 单因素提取影响试验 2.1.1 提取溶剂浓度对黑花生中原花青素提取效果的影响 研究表明，原花青素在水中的溶解度要大于在有机溶剂中的，但是水作提取剂会溶入其他如多糖、蛋白质等成分，增加分离的难度，所以一般用有机溶剂作为提取剂.常用的有机溶剂提取剂有甲醇、丙酮和乙醇，由于前两种有环境危害，所以选择乙醇作为提取溶剂. 取重量各为1g的处理后的黑花生粉末，按料液比1:18分别加入浓度为20%，35%，50%，65%，80%，95%的乙醇溶液中，放入70℃的恒温水浴锅中水浴30min,抽滤，浓缩，干燥，得到原花青素粗提物，超纯水（或双蒸水）溶解，测吸光度，原花青素含量计算方法按照1.2.2中的操作，重复3次取平均值，由公式（1）计算原花青素的含量，结果如图2所示. 图2 乙醇浓度对提取效果的影响 由图2可知，黑花生原花青素的提取量与乙醇浓度之间并没有明显线性关系，其中在浓度35%和80%处原花青素的提取量比较大，而且乙醇浓度35%的原花青素提取量大于乙醇浓度80%的原花青素提取量，大约高出40.2%.由图可知，乙醇浓度65%时提取量最低，且图像走势大约以乙醇浓度65%为对称轴，大体上呈两侧对称趋势，表明在乙醇和水比例接近1:1时，原花青素的溶解度较小，这可能与其多羟基的分子结构有关，含醇羟基的有机溶剂对多酚具有良好的溶解性，含水的有机