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黑龙江口岸斑点热群立克次体调查研究*
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鞠文东 程 成** 付维明 王延禄 呼满霞 梁慧杰 王红霞 徐 宁 耿 聪
(1. 黑龙江国际旅行卫生保健中心,哈尔滨 150001;2. 绥芬河出入境检验检疫局,黑龙江绥芬河 157301;3.萝北出入境检验检疫局,黑龙江萝北 154201;4. 同江出入境检验检疫局,黑龙江同江 156401)
斑点热群立克次体(Spotted fever groupRickettsia, SFGR)是引起斑点热的一组病原体,可引起包括落矶山斑点热、钮扣热、北亚热、昆士兰斑点热、立克次体痘和日本红斑热在内的多种疾病(孙秀峰等,2007)。SFGR种类繁多,目前已确认10多种对人致病的立克次体(Steveetal., 2006),从最早发现的立氏立克次体,到后来逐渐发现的小蛛立克次体Rickettsiaakari、蒙他拿立克次体Rickettsiamontanensis和扇头蜱立克次体R.rhipicephali,目前已发现多种新型的病原体(范明远,2005),如日本立克次体R.japonica、黑龙江立克次体R.heilongjiangii、斯洛伐克立克次体R.slovaca、非洲立克次体R.africa、虎林立克次体R.hulinii以及最新发现的劳氏立克次体R.raoultii和新塔拉塞维奇立克次体CandidatusR.tarasevichiae。
现已证实SFGR是一组经蜱或螨叮咬传播的专性细胞内寄生菌,引起的斑点热属于自然疫源性特征的人兽共患疾病(Cameretal., 2003)。在野生动物、节肢动物与SFGR三者的生态循环中,蜱、螨既是重要的传播媒介又是立克次体的保菌宿主(叶晓东等,2008),尤其是黑龙江中俄口岸生物资源丰富,适合蜱类大量繁殖,具备蜱媒传染病的生态学与生物学基础(吴琼等,2012),所以能了解黑龙江口岸地区斑点热群立克次体在人群、鼠类、蜱类中的分布特征是有重要意义的。本研究针对黑龙江多个口岸,从口岸人群血液样本、鼠类样本、蜱类样本角度出发,在2014年4~7月份开展了针对斑点热群立克次体监测和实验室检测,现报告如下:
1 材料与方法
1.1 样本的采集
1.1.1人员样本的采集:(1)监测地区:东宁、牡丹江、同江、密山、萝北。(2)监测人群:从上述口岸入出境人员中选择如下重点人群:森林采伐、皮毛加工、畜牧业等行业从业人员;多次往返于中俄两国的劳务人员;有发热或其他疑似传染病症状者。以上人群填写流行病学调查表及知情同意书。(3)实验室处理:血液样本采用未使用抗生素的EDTA抗凝血,4 000 r/min离心5 min后,吸取血液白细胞层200 μL提取DNA(张丽娟,2005)。
1.1.2鼠类样本的采集:(1)监测地区:东宁、哈尔滨机场、嘉荫、虎林、密山。(2)实验室处理:选取鼠脾脏,低温研磨处理,吸取200 μL匀浆液备用。
1.1.3蜱类样本的采集:(1)监测地区:东宁、虎林、嘉荫、密山、绥芬河。(2)实验室处理:将蜱在液氮下研磨至粉末状,加入300 μL的生理盐水,吸取200 μL液体备用。
1.2 实验方法
1.2.1引物:引用斑点热群立克次体编码外膜蛋白 ompA 基因,引物名称为Rr190.70p,Rr190.602n,目前该引物因其扩增的基因序列片段具有良好的特异性,同时能够对其进行分类。该引物已较为广泛用于斑点热群立克次体感染的实验室诊断与调查研究(Regneryetal.,1991)。
1.2.2DNA提取:吸附柱法,将200 μL实验样本按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。
1.2.3PCR扩增及测序:PCR反应体系:总体积为25 μL,去离子水18.5 μL,10×PCR缓冲液2.5 μL,2.5 mmol/L的dNTP 0.5 μL,Taq DNA聚合酶0.2 μL,10 mmol/L上下游引物各0.5 μL,样本DNA 2 μL;PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,38个循环; 最后72 ℃延伸7 min。取PCR产物5 μL,用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶成像仪观察结果。鉴定确定后,经PCR产物进行回收与纯化,送与生物公司测序。所测序列与NCBI网上序列进行同源行比较,以确定所测菌液的种型。
2 结果
2.1 监测结果
2.1.1人群监测结果:将此次口岸重点监测人群针对年龄、性别、职业进行了细化(表1)。从年龄上看,以中年人群为主,其中年龄在41~60岁的人群比例最高,为67.44 %;性别上以男性为主,占比90.69 %;职业上,农民群体占比为92.55 %。其中部分人群有蜱叮咬史。
表1 不同口岸的人群分布特征
续表
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