齐整小核菌发酵产胞外多糖的培养基优化研究.docxVIP

? ? 齐整小核菌发酵产胞外多糖的培养基优化研究 ? ? 张 丽，柳昊睿，赵馨仪，翟 丽，黄福山，黄正梅，王 敏* （1.德州昂立达生物技术有限公司，山东 德州 253000；2.天津科技大学 生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津 300457） 多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，目前已经成为分子生物学、食品科学、药学等领域中的热点研究内容之一[1-3]。随着分子生物学的发展，人们逐级认识到糖及其复合分子具有极其重要的生物学功能，多糖具有抗凝血、抗感染、降血糖和降血脂等作用。多糖还可以控制细胞分裂和老化，与细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切的关系[4-8]。 进入21世纪以来，利用生物技术生产聚合物和生物分子得到了长足的发展。与传统化学技术相比，生物技术具有化石资源消耗少、反应条件温和、环境友好等诸多优点。一些微生物最近被用于经济地生产微生物多糖。硬葡聚糖是一种非离子型、水溶性多糖，是由丝状真菌小核菌属纯培育发酵获取，此中最典范的是齐整小核菌。小核菌多糖[9-11]拥有良好的水溶性、粘度、增稠性和稳定性[12]。近几年来，国内外的研究者对微生物发酵产多糖的优化方面也做了大量研究，WANG L Y等[13]利用一株新菌株Kosakonia cowaniiLT-1进行发酵生产胞外多糖的研究。通过比较转录组学分析，了解蔗糖对胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）生物合成的影响。向蓉等[14]通过探究龙眼多糖添加量、发酵时间、接种量和初始pH对丁酸梭菌活菌量的影响，使总多糖含量比发酵前提高了464.65 mg/mL。FENG J等[15]通过优化发酵条件将灵芝的细胞内多糖产量提高到1.98 g/L。 考虑不同培养条件对齐整小核菌发酵产多糖量[14]的影响，从氮源、碳源、无机盐等多个因素进行培养基的优化和设计。近年来，多糖被广泛用于制药、化工和保健品行业中，应用领域不断扩大，需求量不断增加[17-18]。随着我国人民生活水平逐步的提高，多糖产品在国内市场的需求量也将逐渐增加。因此，对于怎样提高多糖产量显得尤为重要，首先利用Plackett-Burman法[19-20]可以快速有效的从许多因素中筛选出较为首要的几个因素，其次利用最陡爬坡试验及Box-Behnken试验优化培养基的配方[21-23]。本研究将对齐整小核菌发酵产多糖的培养基中的碳源、氮源以及无机盐进行优化，提高其胞外多糖产量。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 试验菌种 齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）ATCC 15205：保藏于天津科技大学微生物制药研究室。 1.1.2 化学试剂 酵母浸粉、胰蛋白胨（均为生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司；酵母膏、大豆蛋白胨、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；七水硫酸镁、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖（均为分析纯）：天津市耀华化工厂；磷酸氢二钾、氯化钠、硝酸钠、氯化钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸锌、磷酸、乙醇（均为分析纯）：天津化学试剂二厂。 1.1.3 主要培养基 基础液体培养基：葡萄糖100.0 g/L，NaNO33.0 g/L，KH2PO41.3 g/L，柠檬酸0.7 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，维生素B13.3 mg/L，ZnSO4·7H2O 3.3 mg/L，酵母提取物1.0 g/L。pH=4.5～4.7（磷酸调节）。 马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L，水1 000 mL，自然pH。 1.2 仪器与设备 LD5-10型低速离心机：北京医用离心机厂；EMS-4B磁力搅拌器：天津欧诺仪器仪表有限公司；Agilent1200高效液相色谱系统：美国安捷伦公司；HYG-II回转式恒温调速摇床：上海欣蕊自动化设备有限公司；DL102型电热鼓风干燥箱：天津市实验仪器厂；754PC紫外-可见光分光光度计：上海菁花科技有限公司；FA2204B电子天平：上海精密科学仪器有限公司；ZHJH-1112超净台：上海智诚分析仪器制造有限公司；SS-325型全自动灭菌锅：日本TOMY仪器有限公司；SAB-40E生物传感仪：山东省科学院生物研究所。 1.3 试验方法 1.3.1 发酵产胞外多糖工艺流程及操作要点 配制培养基并灭菌→接种→液体发酵→过滤→浓缩→除蛋白、色素等→醇沉→离心并干燥→粗多糖 操作要点： （1）接种：按5%接种量向发酵液中接入种子液。