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乌鲁木齐市奶牛结核菌素皮内反应检测结果分析 淋巴结是由分枝杆菌引起的一种重要的慢性传染病，在全世界范围内传播。这种疾病不仅损害了养牛业的可持续发展，而且损害了人类的身心健康。牛结核病OIE列为B类动物疫病, 我国列为二类动物疫病。随着我国人民生活水平的提高, 人们对牛奶和乳制品需求量的急速攀升, 带动了奶牛业的迅猛发展, 牛结核病也正日益受到密切关注。而且牛型和人型结核可互相感染, 对人类健康构成巨大威胁。本文针对乌鲁木齐市奶牛和人结核病进行了流行病学调查和研究, 基本掌握了其流行特点。 1 试验材料 1.1 材料、试剂与仪器 精密电子天平、Sartorius高速冷冻离心机、恒温培养箱、超净工作台、显微镜, 电子数显卡尺 (杭州钱塘江工具量具有限公司, 浙, 型号150mm/6in) , 微量金属注射器 (报春鸟牌, 2.5ml) , 电动推毛剪 (深圳市宝安区沙井镇科德士电子厂, 型号:CP-8000) 。 1.2 比较全乳酸酯试剂 国产牛PPD购于哈药集团生物公司 (原黑龙江省生物制品一厂) , 批号20404;比较变态反应试剂包括进口牛型提纯结核菌素和Bovigam禽型提纯结核菌素购于北京测迪科技有限公司;BOVIGAMTM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒, 购于北京测迪科技有限公司。 1.3 染色溶液 萋—尼氏 (Ziehl-Neelsen) 抗酸染色法染色液。 1.4 培养基 L-J培养基和改良L-J培养基。 1.5 实验动物 来源于乌鲁木齐14个规模养牛场和8个区、县的散养户奶牛以及乌鲁木齐市与奶牛结核病相关的人员。 2 实验方法 2.1 内变量试验，牛结核菌素皮 依据中华人民共和国国家标准《动物结核病诊断技术 (GB/T 18645-2002) 》进行。 2.2 皮内主发酵试验 与牛PPD变态反应试验相同, 在注射牛PPD的同时, 在牛颈部的另一侧同时注射进口的牛型和禽型PPD, 两者间隔约12~15cm处, 剂量分别为3 000IU/头份和2 500IU/头份。结果判定: 对牛型结核分枝杆菌PPD的反应为阳性 (局部有明显的炎性反应, 皮厚差大于或等于4.0mm) , 并且对牛型结核分枝杆菌PPD的反应大于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应, 二者皮差在2.0mm以上, 判为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。 对禽型结核分枝杆菌PPD反应大于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应, 两者的皮差在2.0mm以上, 判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。 2.3 -干扰检测 2.3.1 抗原刺激:每头牛采集5ml血液肝素抗凝血液, 室温下于30h内运送到实验室。将采集的每份抗凝全血各取1.5ml加入3个不同孔中, 然后取100μl的牛型PPD、禽型PPD和阴性对照磷酸盐缓冲液 (PBS) , 分别加入至抗凝全血中, 充分混匀后置于含5%CO2的培养箱中37℃培养16h。用移液器小心吸取培养的上清, 转入至1.5ml离心管中, 即为刺激产生的γ-干扰素上清。 2.3.2 牛γ-干扰素酶联免疫吸附试验 (ELISA) :单抗包被板上每孔加入50μl样品稀释液, 然后加入50μl待测样品或对照, 混匀后室温作用1h;洗涤, 每孔加入100μl酶标抗体, 室温作用1h;洗涤后每孔加入100μl底物, 室温避光作用30min后, 加入终止液, 测定OD450nm值。当牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1, 且牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1视为阳性, 反之为阴性。 2.4 耐药阳性标本的制备和判断 2.4.1 按照《全国结核病防治工作手册》和《中国结核病防治规划实施工作指南》的方法, 对普通人群进行胸部X线检查。咳嗽、咳痰超过3周或有咯血的肺结核可疑症状者, 胸透发现异常阴影及已知肺结核患者均摄胸部X线片;对胸透异常及有肺结核可疑症状者均收集3个痰标本 (即时痰、夜间痰和次日清晨痰) , 3个痰标本进行涂片和对前2号标本培养, 通过改良罗氏分类方法对培养阳性的标本进行菌型鉴定。 2.4.2 对结核病阳性牛密切接触人群和易感人群采用结核病PPD检测, PPD检测应在皮内注射结核菌素后72h观察结果。注射部位的红晕多系非特异反应, 不作为判断标准, 应以注射部位的硬结大小判断, 硬结平均直径大于等于5mm者为阳性, 10~19mm为中度阳性, 大于等于20mm (儿童15mm) 为强阳性, 如硬结平均直径小于20mm但有水泡、坏死均为强阳性反应。然后对PPD阳性人群进行胸部X线检查, 对胸透异常及有肺结核可疑症状者均收集3个痰标本, 通过改良罗氏分类方法对培养阳性的标本进行菌型鉴定。 3 结果 3.1 立地条件检测结果 通过对全市14个规模奶牛场