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透明质酸水凝胶对骨髓间充质干细胞三维培养的影响 0 透明质酸水凝胶 心血管疾病是人类健康的最大威胁。由于心脏细胞几乎没有再生能力，死心肌组织最终被纤维组织取代，心率下降。近年来,研究者将具有分化潜能的干细胞移植到心肌梗死部位,试图达到恢复心脏功能的目的。但随着研究的开展,发现超过90%的移植细胞在24 h内即大量逃逸,细胞治疗的效果受到质疑。于是,采用可降解的生物材料,如胶原、Matrigel等作为细胞载体防止细胞逃逸的方法引起了关注。 可注射水凝胶除了能携带细胞之外,还能为干细胞的存活和生长提供理想的微环境,因此具有较大优势。透明质酸是一种分布在多种组织细胞外基质中的蛋白多糖,具有良好生物相容性,并在生物发育和机体损伤修复过程中发挥重要作用。因此,基于透明质酸的水凝胶已成为一种有前景的生物材料,并在三维细胞培养、组织工程支架以及再生医学领域得到广泛应用。作为三维培养基质,透明质酸水凝胶能够支持干细胞的生长行为,例如干细胞的表型、活性、增殖、迁移和分化等,更重要的是这些生长行为跟水凝胶的机械性能和内部结构关系密切。有研究指出,干细胞对培养基质的硬度和结构能直接做出应答反应,从而影响自身的一些生长行为。在以往的关于透明质酸水凝胶的研究中多采用单一浓度,因而目前关于透明质酸水凝胶浓度的改变对水凝胶的基本性能以及水凝胶内细胞生长行为的具体影响还没有完全认识清楚。因此,在透明质酸水凝胶治疗应用之前,分析设计水凝胶的优越性能以及建立利于干细胞存活和生长的最佳培养条件对于组织工程和再生医学的应用具有重要意义。 目前透明质酸水凝胶在心血管领域的应用研究较少,文章对透明质酸水凝胶的特性作初步研究,制备不同质量浓度水凝胶并探讨浓度的改变对其基本性能以及对大鼠骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态和分布的影响,为进一步深入研究奠定基础。 1 体外功能检测 设计:水凝胶性能分析及细胞学体外实验。 时间及地点:于2011年10月至2012年9月在北京协和医学院阜外心血管病医院心血管疾病国家重点实验室完成。 材料: 实验动物:健康雄性4周龄SD大鼠20只,体质量60 g左右,由北京大学医学部提供,许可证号:SCXK(京)2001-0012。动物饲养环境为清洁级,实验过程对动物的处置符合相关动物伦理学要求。 不同浓度透明质酸水凝胶的性能及其对骨髓间充质干细胞形态和增殖影响检测中所用主要试剂与仪器: Main reagents and instruments: 方法: 透明质酸水凝胶的制备:透明质酸水凝胶试剂盒Hy Stem Hydrogel内含冻干状固体Hy StemTM(经巯基修饰的透明质酸)、ExtralinkTM(聚乙二醇二丙烯酸酯)和脱气去离子水3个组分,水凝胶配制按照说明书进行。Hy StemTM和ExtralinkTM分别溶于脱气去离子水后形成凝胶工作液和交联剂工作液,其中交联剂工作液浓度固定为2%,凝胶工作液所需去离子水体积由最终体积减去交联剂用水体积计算而得。将两种工作液按比例混合,待凝固后,最终制备成4,8,12 g/L的水凝胶。 凝胶时间测定:水凝胶工作液和交联剂工作液混合均匀后,立即用移液器吸取300μL混合液转移到离心管内,置于37℃水浴并开始计时,不时倾斜离心管观察溶液是否流动。当液体不再流动时,则认为是形成凝胶,记录此过程的时间。 溶胀实验:采用溶胀实验比较不同质量浓度水凝胶的溶胀性能,以溶胀率表示。待水凝胶凝固成胶体后,称质量得mi,置于37℃的PBS溶液中浸泡过夜,至溶胀平衡,从PBS中取出并再次称质量得mw,计算溶胀率。 体外酶降解实验:通过测定透明质酸酶降解水凝胶导致的质量损失获得。Ⅳ型透明质酸酶工作液用PBS配制,浓度为300μg/L。水凝胶凝固后在PBS溶液中溶胀至平衡,称质量,然后置于37℃透明质酸酶工作液中至完全降解。降解速率通过公式计算得出。 黏弹性测定:通过流变仪测定水凝胶的黏弹性,黏弹性是以存储模量(G′)和损耗模量(G″)的形式测量,其中存储模量(G′)代表弹性,损耗模量(G″)代表黏性,这两个参数代表材料的相对硬度。取3种浓度的透明质酸水凝胶,PBS中37℃溶胀至平衡,置于流变仪平行板顶部,裁剪成直径25 mm圆形形状,厚度为1.5 mm。流变仪动态振荡扫描频率的范围设置为0.1-10 Hz,恒定剪切应力设为1%,测量温度设为37℃,分别读取G′和G″。 骨髓间充质干细胞培养、鉴定及包封:采用全骨髓贴壁法从SD大鼠分离获得骨髓间充质干细胞,采用颈椎脱臼法处死大鼠,体积分数75%乙醇浸泡3 min,无菌条件下,取出大鼠股骨和胫骨,剪除干骺端,5 m L注射器吸取DMEM培养基反复冲洗骨髓腔于培养皿内,将冲出的细胞转移到75 m L培养瓶内,置于体积分数5%CO2、37℃细胞培养箱内培养,48 h后首次换液,