血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候血浆蛋白质表达谱研究.docxVIP

血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候血浆蛋白质表达谱研究 作为蛋白质组学的一个分支，血浆蛋白质组学是科学研究血浆中所有蛋白质的组成、在特定条件下的表达以及它们之间的关系的科学科学。人类血浆蛋白有以下几个特点:(1)数量最多,(2)来源广,(3)含量差别非常大,可至10个数量级,(4)是所有组织或细胞中与mRNA表达水平相差最远的蛋白质。而且血浆取材容易、应用广泛,这些蛋白成分在不同的疾病状态下其丰度和结构发生不同的变化。因此,在整体水平上研究血浆蛋白质的表达水平、翻译后修饰、相互作用等,并由此在血浆蛋白水平上获得疾病过程和药物干预过程的外在、综合的认识,在医学基础和应用研究中都有着重要意义。 应用蛋白质组学的方法,按照病证结合模式,全面研究血浆中蛋白质表达谱的变化规律,有望从整体上揭示某一疾病的不同中医证候在特定时空条件下的特异性和变化规律。 大量的研究报道了血脂异常或动脉粥样硬化或冠心病不同痰瘀证候的患者,在全身众多系统中,诸如脂蛋白、凝血-纤溶系统、免疫系统等,其蛋白质存在着数量和某些结构上的显著差异。因此,我们推测血脂异常及动脉粥样硬化不同痰瘀证候在蛋白质组水平上存在某些功能蛋白表达量的显著差异性,及其相互关系间的某些标志性蛋白种类上的兼容性和由痰致瘀过程中存在某些关键蛋白的结构性或功能性变化的特点。 本研究以血脂异常及动脉粥样硬化痰瘀证候临床患者为研究对象,采用二维凝胶电泳技术(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2-DE),寻找不同痰瘀证候可能的特异性标志蛋白群,为中医证候临床诊断以及治疗提供客观依据。 材料和方法 1 材料表面 1.1 不同缓冲液及二硫苏糖醇缓冲液的合成 固相pH梯度干胶条(pH3-10,18 cm),IPG缓冲液均为GE公司产品,二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、CHAPS均为上海生工产品。 1.2 凝胶质谱仪检测 高速离心机(德国Beckman公司)、Ettan IPG phor Ⅱ等电聚焦仪(GE公司)、Ettan Dalt six垂直板电泳槽(GE公司),电泳仪(EPS1001)、labscan凝胶图像扫描仪、Imagemaster 6.0凝胶分析软件和Q-TOF质谱仪。 2 动脉联压药患者年龄分布 病例收集自2004年5月—2005年8月在中国中医科学院广安门医院和西苑医院心内科住院确诊的血脂异常及用左侧颈动脉超声诊断确定的动脉粥样硬化患者146例,其中,痰瘀互阻证41例,痰证32例,血瘀证38例,非痰非瘀类证候35例,年龄为35～55岁,平均年龄45岁,另选年龄匹配的健康人37名。 所有入选病例于清晨空腹抽取静脉血4.0 mL (EDTA抗凝),30 min内离心(3 500 r/min,15 min),分离血浆,分装后-80℃储存备用。 3 方法 3.1 sds-管定电泳 采用IPG phor Ⅱ聚焦系统进行第一向等电聚焦。取20 μL血浆样品与300 μL重胀液混合,将pH 3-10,18 cm非线性IPG胶条重胀,12 h后,聚焦24 h,梯度升压至8 000 V。聚焦结束后,IPG胶条在含1%的DTT和2.5%的IAM 10 mL平衡液中进行二步平衡。平衡好的IPG胶条转入预制好的15%聚丙烯酰胺凝胶板上部,进行第二向SDS电泳。分析胶采用考马斯亮蓝染色(按Neuhoff胶体考马斯亮蓝G-250的方法进行)后,采用Labscan凝胶图像扫描仪进行扫描。 3.2 血浆2-de图谱 采用Imagemaster 6.0图像分析软件对血浆2-DE图谱进行差异分析,比较蛋白斑点的数量及蛋白表达量,获取不同证候的差异蛋白质表达谱及其在不同痰瘀证候间传变的变化规律。 3.3 苯基碳酸盐系对甲基碳酸氢铵稳定性的影响 切取确定的差异蛋白质斑点,置于1.5 mL Ep管中,用含50%乙腈和2 mmol/L碳酸氢铵溶液脱色,胶片真空离心干燥后,加入4 μL胰酶,37 ℃保温18 h,再加入5%三氟乙酸12 μL,40 ℃保温1 h,吸出上清,加入含2.5%三氟乙酸的50%乙腈溶液120 μL于30 ℃保温1 h,合并上清液冷冻干燥。 3.4 q-tof-ms分析 用5 μL三氟乙酸溶解样品。取1 μL样品点靶,另取1 μL α-腈基-4-羟基肉桂酸溶于0.1%三氟乙酸/50%乙腈的饱和溶液作基质,室温干燥后,于Q-TOF-MS质谱仪上进行质谱分析。质谱峰采用Bruker的肽段标准或胰酶的自切峰进行标定。 3.5 数据库中的蛋白质研究 3.6 -de图谱分析与标志蛋白群筛选 采用Fisher典型性分析方法,对由2-DE图谱分析获得的不同证候差异蛋白质表达谱进行组间典型成分的判别分析,筛选出具有显著区分功能的标志蛋白质群。 差异表