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心肌缺血再灌注模型的改进 人们认为，最有效的治疗方法是脉搏再注，再次注射损伤后再灌。因此，重新造林的研究和预防已成为研究的重点。大鼠以其冠状动脉侧支循环少、心肌坏死出现早、心律失常发生率高、重复性、稳定性好、费用低廉而成为制作心肌缺血再灌注损伤模型的首选实验动物。传统的模型制备操作复杂、耗时长、成功率低,为此,我们对模型制备进行了改进,并且观察了手术前后心电图变化及病理改变,现报道如下。 1 材料表面 1.1 动物 健康♂SD大鼠,月龄11~12周,体重200~300 g,由安徽医科大学实验动物中心提供(皖医实动准字第02号)。 1.2 特效药 水合氯醛、硝基四氮蓝(NBT)染色剂(Sigma公司生产)。 1.3 仪器 BL-420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司);电子天平。 1.4 试剂 心肌酶普试剂盒购自中外合资上海长征-康红医学科学有限公司。 1.5 室内温度 20~25℃ 2 心功能检查及统计分析 2.1水合氯醛腹腔注射(0.6 mol/L,3 ml/kg)麻醉后仰卧位固定在鼠板上。 2.2测量术前标准Ⅱ导联心电图并存入电脑。 2.3剪去胸前手术区毛,剪开皮肤、皮下组织、胸前肌肉及筋膜3~4 cm,用角针4号线在切口两端穿线(连同胸前肌肉、筋膜及皮下组织)不结扎。于左侧第四肋间,用18#血管钳沿第四肋间,钝性分离肋间肌3 cm长,打开胸腔,撑开4、5肋骨,用左手拇指及四指将心脏挤出胸腔。助手用左手拿小镊子夹一小棉球,用棉球将心脏向右面轻推,在左心耳与肺动脉圆锥之间找到与左冠状动脉伴行的心大静脉,在左心耳下方2 mm处用眼科针3-0丝线穿线,进针深度为1~1.5 mm,宽2~3 mm,连同心大静脉一齐结扎冠状动脉左前降支(假手术组只穿线不结扎),结扎前于心大静脉处放一实心玻璃丝引线(1.5~2.0 mm),引线用石腊油润滑。结扎冠状动脉后迅速将心脏放入胸腔,轻挤胸腔排出胸腔气体,同时提拉已穿好的缝皮4号线并结扎,两线之间皮肤用12#~14#血管钳夹紧闭合胸腔,引线尾端留在胸外。结扎过程要在1~2 min内完成,术后如呼吸不好,胸外人工按摩几次,待自主呼吸稳定。 2.4结扎30 min后,拔去引线使冠状动脉再通,并观察心电图有无再灌注心律失常。并记录存入电脑。 2.5再灌注120 min后,再次记录心电图并存入电脑。然后打开腹腔从腹主动脉取血3~5 ml,放置1~2 h,离心15 min(2 000 r/min),取血清放置-70℃冰箱待测。 2.6立即取下心脏剔除心房、结缔组织及右室,用生理盐水洗去血液,平行房室沟将左心室切成1.5 ~2 mm厚共5~6片,置37℃ 0.25% NBT染液中染色15 min。坏死区心肌呈灰白色,未坏死心肌呈蓝色,用吸水纸或纱布吸去水份,切下坏死区心肌,电子天平称重并记录,计算梗死区心肌重量占左室重量百分比。然后心肌放入甲醛溶液中留待做病理。 2.7 结扎成功的标志①结扎后1~2 min内可见心电图J点或ST段抬高与高耸的T波融合,呈弓背向上单向曲线,如图1;②NBT染色后肉眼观坏死区心肌呈灰白色,未坏死心肌呈蓝色;③病理检查有心肌缺血和心肌梗死;④心肌酶升高。四项有一项者为结扎成功。 结扎后心电图J点抬高与高耸的T波融合呈锯齿样改变,并可见室早二联律。 2.8 心肌酶化验采用日立7170A全自动生化分析仪检测AST、LDH、CK-MB。 2.9 统计学处理计量资料均以ˉx±s表示。组间比较采用t检验。 3 结果 3.1 模型制备工艺 制备大鼠心肌缺血再灌注模型25只,成功20只,成功率80%。每只模型制备从开胸到关胸需用1~2 min,从麻醉到关胸需用10 min。随机分为两组:假手术组和缺血再灌注组。 3.2 心电图st段的变化 假手术组,手术前后心电图ST段无明显改变;缺血再灌组,冠状动脉结扎后心电图ST段与结扎前比较明显抬高。见表1。 3.3 心肌酶测定 如表2,缺血再灌组,冠状动脉结扎30 min,再灌注120 min后,心肌酶较只穿线不结扎的假手术组明显升高。 与假手术组比较:*P0.01 3.4 再开放注射对心肌的影响 如表3,假手术组,手术后心肌未发现梗死;缺血再灌组,心肌梗死面积为26.7%±2.9%。 4 微创模型的制作 冠状动脉左前降支是左心供血的最主要血管。如果此血管发生阻塞可引起室间隔、左室前壁发生心肌梗死。结扎冠状动脉左前降支是研究心脏缺血再灌注损伤最好的血管。我们采用改进的手术方法结扎冠状动脉左前降支,与假手术组比较,发现结扎后心电图J点在2 min内明显抬高;再灌注120 min后心肌酶明显升高;左心切片NBT心肌染色,心肌梗死面积为26.7%,说明造模成功。传统的大鼠心肌缺血-再灌注模型制备需要气管插管、呼吸机人工呼吸、给氧;结扎冠状动脉在胸腔内