改良双侧颈总动脉永久性冻结模型对大鼠血管性痴呆模型的改良.docxVIP

改良双侧颈总动脉永久性冻结模型对大鼠血管性痴呆模型的改良 血管性脑瘫（vd）是由多次脑卒中或长期慢性脑缺血引起的高级脑功能减退引起的。随着我国人口老龄化,VD患者也逐渐增多。建立一个有效的VD动物模型,对探究VD的病因、发病机制及筛选防治药物都有很大的帮助。双侧颈总动脉持久性结扎法(permanent bilateral comman carotid artery occlusion,2 VO)是目前国内外流行的VD动物模型制作方法,其优点是操作简便,大鼠学习记忆能力降低显著,而无神经功能缺损症状。但传统2VO方法对双侧颈总动脉(common carotid arteries,CCA)同时进行结扎,对动物打击过大,动物死亡率高,从而导致实验费用增加、实验周期延长。为了降低2VO造模法制作的血管性痴呆模型动物的死亡率,本实验对传统方法进行了改良,采用分次结扎双侧CCA制作血管性痴呆大鼠模型,即第一次仅结扎一侧CCA,一周后结扎另一侧,观察术后动物死亡率、大鼠学习记忆能力改变及其对海马区病理形态学的影响。 1 材料和方法 1.1 动物实验设施设计 选用广东省医学实验动物中心提供的健康SD大鼠50只,雄性,250~300 g,SPF级,实验动物质量合格证明编号:0055433,饲养于中山大学实验动物中心屏障环境中,动物实验设施使用证明编号:0042618。动物经适应性喂养一周后采用Morris水迷宫定位航行实验进行筛选,淘汰学习记忆能力差的大鼠。将合格大鼠采用随机数字表法随机分为传统法模型组(n=15)、改良法模型组(n=15)、假手术组(n=10)。 1.2 颈前活检去皮大鼠皮肤损伤模型 传统法模型组:两侧CCA在同一时间进行永久性结扎。大鼠术前12 h禁食,不禁水,用10%水合氯醛(350 mg/kg体重)腹腔注射麻醉大鼠,仰卧位固定于手术台上,颈前部手术区域去毛,碘酒消毒,于颈部正中切开皮肤及皮下组织,取颈前正中切口,钝性分离皮下结缔组织、颈前肌群,仔细分离暴露左、右两侧CCA,以“0”号丝线结扎双侧CCA的近端及远端,并从中间剪断,以彻底阻断CCA血流。最后逐层缝合皮下结缔组织、皮肤。改良法模型组:第一次仅结扎、剪断一侧CCA,一周后对另一侧CCA结扎、剪断,手术操作步骤同传统模型组。假手术组:大鼠仅做颈前切口,分离、暴露双侧CCA,不结扎也不剪断CCA。术后各组大鼠均在屏障环境中继续饲养、观察。 1.3 观察指标 1.3.1 术后7天的存活率 记录各组大鼠7 d内的死亡情况,计算存活率。 1.3.2 学习记忆能力 各组大鼠分别于术后8周、12周进行Morris水迷宫(morris water maze,MWM)定位航行实验检测学习记忆能力。每次实验历时5 d,每天分上午、下午两个训练时间段,每段训练4次。记录第5 d其在180 s内寻找到并爬上平台的时间,即逃避潜伏期。若大鼠在180 s内未找到平台,则逃避潜伏期记录为180 s。 1.3.3 灌注及处理脑中骨髓细胞 用10%水合氯醛(350 mg/kg体重)腹腔注射麻醉大鼠后,快速开胸暴露心脏,将灌注针头插入心尖,剪开右心耳使静脉血完全放出,而后夹闭腹主动脉,只灌注头部、胸部及前肢。先灌注生理盐水约100 m L,再用4%多聚甲醛100 m L进行灌注。断头,暴露颅骨,用弯钳仔细剔除颅骨,取下大脑,将脑置于4%多聚甲醛固定液中浸置4~6 h(4℃),而后取视交叉后2~6 mm至小脑前含海马区的脑组织用PBS漂洗,经常规脱水、透明后,浸蜡包埋,蜡块5μm连续切片。常规HE染色。 1.4 实验结果与分析 采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。所有数据结果均以x珋±s表示,采用x2检验比较传统法模型组与改良法模型组的存活率;采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组大鼠的学习记忆能力,两两比较采用q检验。P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 动物存活率 术后7d,传统法模型组(n=15)存活6只,改良法模型组(n=15)存活13只,假手术组(n=10)存活10只;改良法模型组动物存活率(86.7%)明显高于传统法模型组(40.0%)(P0.05)。各组存活率见表1。 2.2 周数对大鼠逃避刑期的影响 各组大鼠术后8 w、12 w水迷宫逃避潜伏期结果见表2。随着术后周数的增加,各组大鼠的逃避潜伏期均延长。在8 w和12 w,与假手术组相比较,传统法模型组与改良法模型组逃避潜伏期均显著性延长(P0.05),而改良法模型组与传统法模型组之间比较无显著性差异。 2.3 组织学检测细胞结构正常 HE染色后,光镜下可见假手术组大鼠海马区神经元排列整齐、密集,细胞完整,结构正常,胞浆丰富,胶质细胞无增生;细胞核呈圆形、椭圆形,无变性、无固缩或溶解现象。传统法模