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铁皮石斛组织培养技术研究进展 又名黑节草和慈姑，属于木兰科植物，为多年生草本植物。 根据《中华人民共和国药典》中记载, 石斛是一种极为珍稀名贵的中药材。2005年版的《中国药典》石斛项下收载有三种, 分别是金钗石斛、铁皮石斛和马鞭石斛;2010年版的《中国药典》已经将铁皮石斛作为单列药材品种, 并将金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛收载其中。千年以来, 石斛一直与灵芝、人参、冬虫夏草等被列为上品中药, 被誉为“中华九大仙草之首”。铁皮石斛是市场上许多成品中药和保健品的重要原料, 如“脉络宁”注射液、“清咽宁”、“益胃汤”等等。铁皮石斛以新鲜或干燥茎入药, 具有益胃生津、滋阴清热等功效;用于热病津伤, 口干烦渴, 胃阴不足, 食少干呕, 病后虚热不退, 阴虚火旺, 骨蒸劳热, 目暗不明, 筋骨痿软。现代医学研究证实, 铁皮石斛不仅含有人体所需的17种氨基酸和丰富的微量元素, 还含有石斛多糖、石斛碱、鼓槌菲和毛兰素等药用成分, 具有抑制肿瘤、延缓衰老、增强人体免疫力、降低血糖和抗血小板聚集等作用。 铁皮石斛的种子极为细小, 胚胎发育不完全, 缺乏胚乳组织, 萌发率极低 (不足5%), 且自然条件下必须与兰菌共生才能萌发。因此无法在大田或苗床上播种, 很难生产足够的实生苗用于栽培。铁皮石斛对生长环境要求苛刻, 成苗更困难。传统的人工繁殖方式如分株、扦插等, 繁殖速度慢, 增殖率很低。铁皮石斛具有极高的药用价值和经济价值, 长期依赖采挖野生资源来满足市场需求。由于无节制的采挖以及铁皮石斛自身生长、繁殖特性和对生长环境的特殊要求等原因, 导致其野生资源日益稀少, 种源已临枯竭。目前铁皮石斛已被列为国家重点保护药用植物、中国珍稀濒危二级保护植物和世界二类保护植物。目前铁皮石斛鲜条市场收购价为每公斤600~1000元, 其加工品优质“铁皮枫斗”国内售价已达12000~30000元/kg, 国际价市场售价高达2500~3600美元/kg。据最新统计, 目前全国铁皮石斛鲜条年产量还未达到200吨, 远远满足不了市场需求。 1 加强对铸铁矿的组织培养 利用组培快繁技术繁殖试管苗, 不仅是解决铁皮石斛野生资源紧缺的有效方法, 也对该物种的种质资源保护起到积极的作用。 1.1 铁皮石斛的诱导诱导愈伤组织产生 近年来, 用于研究铁皮石斛组织培养和快速繁殖的外植体材料主要有根尖、茎段、腋芽、茎尖、叶片和种子[24,25,26,27,28,29]等。其中以种子作为外植体进行离体培养的研究较多。 秦廷豪以铁皮石斛无菌苗分成的茎段、带顶芽的茎段和根蔸3类外植体在MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.2mg·L-1上均能诱导出丛生芽, 只有根蔸能诱导原球茎, 且诱导丛芽倍数高于其他两类。李进进、张书萍、陈媛、何涛以铁皮石斛带芽茎段或腋芽作为外植体直接诱导产生丛生芽, 曾宋君利用茎尖诱导愈伤组织产生不定芽进行组织培养研究。王丽萍、张启香以茎段或茎尖诱导原球茎, 通过原球茎的增殖分化从而获得大量的铁皮石斛幼苗。 适量的6-BA、NAA能够促进幼叶直接成苗或愈伤组织的产生。蒋向辉等认为利用铁皮石斛幼叶为外植体, 诱导不定芽的最适培养基为1/2MS+1.25mg·L-16-BA+0.8mg·L-1NAA+25g·L-1蔗糖。王云、邓珂比较4种不同基本培养基和4种不同浓度的6-BA, 得出N6+6-BA1.0mg·L-1为铁皮石斛嫩叶诱导愈伤组织的最适培养基。 曾宋君、谢启鑫、洪香娇、郑宽瑜、汤亚飞以铁皮石斛种子作为外植体诱导原球茎, 进行组培快繁的研究。在铁皮石斛或其他石斛属植物的组织培养研究中发现, 种胚培养的原球茎质量较高, 而且繁殖速度是丛生芽增殖方式的几倍甚至几十倍。 1.2 基本培养基的制备 选择合适的培养基是组织培养的关键。MS、N6、B5、KC、VW等基本培养基均可用于石斛离体组织培养。 在石斛茎尖培养中, N6培养基诱导愈伤的能力明显不如MS;KS、VW、Kundson C效果也欠佳。在胚培养中, 以硝态氮远高于铵态氮的SH培养基、改良N6培养基的萌发和成苗效果较好;兰科植物组织培养中常用的MS、KS、VW、Kundson C培养基效果不如前二者。使用蛋白胨为主要成分配制成PT培养基代替N6培养基, 萌发率、生长速度和生长势均达到或超过N6培养基水平。 周俊辉等比较4种不同的基本培养基对铁皮石斛芽的诱导和增殖的效果, 试验结果表明, B5培养基的效果最好, N6次之, MS较差, KC最差。 在细叶石斛试管苗生根试验中发现, WPM培养基作为基本培养基比较适合细叶石斛的生根, 所需时间最少, 生根数量较多, 植株粗壮, 其次为大量元素减半的MS培养基。 1.3 激素配比对原球茎生长分化的影响 蒋向辉等采用铁皮石斛幼叶为外植体的快繁研究中发现, 6-BA