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白愈伤组织诱导和分化再生体系的建立 b.白俄罗斯。f.也被称为白和、贝壳、鸡、刀、草等。这是兰花科的一种多年生草本植物。其花大色艳,被称为中国洋兰,具有很高的观赏价值,常用于花径、花坛及林下的地被植物等。其假鳞茎是我国传统中药,具有收敛止血、补肺、消肿生肌之功效,外敷治疗创伤出血、痛肿、烫伤和疗疮,内治吐血、肺病、咳血、慢性胃溃疡以及肿瘤等症。现代研究表明,白芨还具有较强的抗氧化和抗衰老作用,可用于保健、护肤及美容养颜。 白芨在我国长江流域及以南地区均有分布,生长区域较广。由于多年的掠夺式采挖,加上生境日益恶化,使得野生白芨的数量急剧减少,濒临灭绝边缘,已被国家列为重点保护的野生药用植物之一。白芨应用日益广泛,人工栽培势在必行。虽然白芨组培快繁技术比较成熟,但是目前栽培仍以分株繁殖为主,存在产量较低、所需的生长周期长等不利于大规模发展人工栽培的因素。因此,改良白芨品种,提高其产量和品质是大规模栽培的前提。 由于愈伤组织是未分化的具有分生能力的原始细胞团,通过对愈伤组织进行基因转化和化学诱导可较快获得新品种。目前,关于兰科植物愈伤组织诱导的文献报道不多,白芨愈伤组织诱导还未见报道。本实验以白芨无菌组培苗为材料,在MS培养基中附加不同种类和质量浓度的植物生长调节剂进行实验,建立白芨愈伤组织诱导与植株再生体系。 1 白组培苗的制备 BBS—DDC型洁净工作台,济南鑫贝西生物技术有限公司;JZ—160型接种器械灭菌器,上海咏星生物科技有限公司。 白芨Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.为广西桂林优良品种,由广西植物研究所刘演研究员鉴定。以白芨种子无菌播种得到白芨组培苗为材料进行实验。植物生长调节剂萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、噻二唑苯基脲(TDZ)均为分析纯,购自Sigma公司。 2 方法 2.1 培养基的制备 培养基:以MS为基本培养基;植物生长调节剂2,4-D、NAA和6-BA分别为A、B和C 3因素,各取3水平,应用正交表L9(3)4设计不同因素水平配比的培养基(表1);再加20 g/L白糖和4.5 g/L琼脂;p H值5.8~6.0;121℃、1.1 kg/cm2下灭菌25 min。 外植体及接种培养:在超净工作台中,将白芨无菌组培苗根、假鳞茎和叶分别切成长度为0.5 cm左右的小段,接入各诱导培养基中,在(25±1)℃、光照强度1 500 lx、光照时间10 h/d的条件下培养。 2.2 在白鹿骨 2.2.1 -ba和2,4-d 根据白芨愈伤组织诱导正交试验结果,设计愈伤组织增殖培养基。以MS为基本培养基,1.0 mg/L 6-BA为固定因素,分别附加0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L 2,4-D;再加20 g/L白糖和4.5 g/L琼脂;p H值5.8~6.0;灭菌。将“2.1”项中诱导得到的愈伤组织切成0.3 cm×0.3 cm小块,分别接入增殖培养基中培养,以筛选白芨愈伤组织增殖培养基。 2.2.2 白愈伤组织的分离培养 根据白芨愈伤组织增殖培养试验,以MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA1.0 mg/L为固定因素,分别添加0、0.1、0.5、1.0 mg/L TDZ;再加20 g/L白糖和4.5 g/L琼脂;p H值5.8~6.0;灭菌。将愈伤组织切成0.5 cm×0.5 cm小块,接入分化培养基中培养,进一步筛选白芨愈伤组织分化培养基。 以上每个处理3瓶,每瓶10个接种点。每7天观察1次,50 d时记录各处理中诱导出外植体的数目、增殖系数和分化率。 3 结果与分析 3.1 白鹿组织的诱导 3.1.1 愈伤组织的诱导率 将白芨无菌组培苗的根、假鳞茎和叶片分别接入按正交设计的9种处理培养基中培养。20 d时,部分根的根尖部位开始膨大;假鳞茎上端组织变得疏松膨大;叶片大部分发黄变黑,小部分保持青色。35 d时,整条根膨大,表面长出黑色的致密愈伤组织;假鳞茎的腋芽点出现部分淡黄色疏松或致密的愈伤组织;只有一张叶片靠近叶柄部分开始膨大,产生淡青色的愈伤组织。50 d时,记录诱导出愈伤组织外植体块数,分别统计根、假鳞茎和叶片的愈伤组织诱导率(表1)。 从表1可知,白芨不同的器官在不同植物生长调节剂种类和质量浓度的培养基培养,愈伤组织诱导率有很大差别。叶片只在7号中培养基中诱导出愈伤组织,诱导率为3.3%。根在1、2、3、9号培养基中培养变黑死亡,在其余培养基中均有愈伤组织形成;但诱导率仅3.3%~23.3%;其中以7号培养基的愈伤组织诱导率最高,为23.3%。假鳞茎在1、2、3、9号培养基中没有愈伤组织产生,但从腋芽处长芽,其中3号培养基的芽长得最壮;在4、5、6、7、8号培养基中有愈伤组织产生,诱导率10.0%~83.3%;