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大豆转基因技术研究进展 大豆最早起源于中国。它不仅是人类最重要的石油和植物种类，也是一个重要的工业原料。植物转基因技术作为一种新兴的生物技术手段,在提高产量、抗性育种以及缩短育种周期等方面有着明显的优势。早在1988年,McCabe和Hinchee分别用基因枪轰击大豆未成熟胚生长点和用农杆菌侵染大豆子叶节的方法获得大豆转基因植株。笔者对大豆转基因的研究与利用方面进行了综述,重点阐述了大豆转基因的主要方法,分析了大豆遗传转化的主要障碍及其可能的解决途径,探讨了转基因大豆的生物安全性问题,最后指出了大豆转基因技术的研究方向。 1 超声波辅助农杆菌转化的方法 大豆转基因的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG法、超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法等。其中,以农杆菌介导法和基因枪法为大豆常用的转基因方法。 1.1 大豆基因型的转化 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。现已发现,与植物基因转化有关的有两种类型:一为根癌农杆菌,含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成冠瘿瘤;二为发根农杆菌,它含有Ri质粒,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染植物时,这段DNA可以插入到植物基因组中,使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA能够进行高频率的转移,而且Ti质粒和Ri质粒上可插入大到50kb的外源基因。因此,Ti质粒和Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。农杆菌转化的方法主要有整体植株接种共感染法和叶盘转化法。1985年,Horsch等发明了叶盘转化法,其操作方法是首先用打孔器从消毒叶片上取得叶圆片,亦称之叶盘。目前,大豆农杆菌转化多采用的是改良叶盘法,外植体主要是子叶、下胚轴和子叶节等。 用农杆菌介导进行大豆的转基因研究是从野生型菌株开始的,Owens研究了大豆品种对农杆菌的敏感性,Byrne等用21个大豆品种研究了大豆品种与农杆菌间的关系。2002年,王罡等研究表明大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性,不同大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性存在显著差异。我国学者王连铮等利用致瘤农杆菌的15个菌系对2 759个大豆品种的致瘤能力进行了研究,筛选出7个致瘤能力较强的菌系。Kudirka等研究了大豆基因型、农杆菌共培养时间对农杆菌转化的影响。Fscciot等将SSU(1,5-二磷酸核酮糖融化酶)、OSU(章鱼碱合成酶)和nptⅡ(新霉素磷酸转移酶)的融合基因通过农杆菌对大豆进行侵染转化,得到的抗性愈伤组织经检测后证明有融合基因的诱导表达。Hinchee等(1988)首次通过农杆菌介导转化获得转基因大豆植株。Di等用含有BPMV外壳蛋白基因的农杆菌侵染大豆,都获得了转基因植株。徐香玲等于1997年和1999年用农杆菌Ti质粒介导分别将Bt(苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因)和菜豆几丁质酶基因导入大豆,得到转化植株,经检测证明外源基因已整合到大豆基因组上。1999年苏彦辉等和Zhao等用农杆菌介导法分别得到转Bt基因和bar基因的大豆转化植株。2001年,赵桂兰等将nptⅡ和Barnase基因导入大豆的幼胚和子叶节中,筛选得到转基因植株,PCR检测证明nptⅡ和Barnase基因已整合到大豆基因组上,转基因植株生物学观察发现,花粉不育率达98%。姬月梅等用农杆菌介导法把与抗逆有关的小麦基因(TaNHX 2)转入大豆,经检测证明目的基因导入并整合到大豆基因组中。目前,从大豆成熟种子分离出的具有选择性的子叶节作为受体进行转化,获得了较高的转化率,能够提高1.5倍,达到8.7%,这是大豆遗传转化率中较高的报道。农杆菌介导法具有技术简单成熟,耗资少,可靠性高,转化率相对较高,可以转移大片段外源基因(30kb),没有明显的基因重排现象,外源基因主要以单拷贝插入植物基因组等优点。 1.2 金粉颗粒对小麦幼苗nptii基因表达的影响 基因枪法又称微弹轰击法。这种技术是借用高压气体或高压放电为动力,用微粒对植物组织进行轰击而将其上的外源基因带入到植物细胞内,优点在于不受基因型和轰击靶组织的限制。Klein等首次在洋葱上对细胞进行试验,并在受体细胞中观察到了病毒RNA的复制。随后,他们还用这种技术将cat(chloram 2phericolkacetyltrandfera se)基因导入洋葱表皮细胞,并从被轰击的表皮组织的提取液中检测到很高的cat活性。Christou等用基因枪法转化未成熟胚,研究表明,金粉粒子深入到5~7层细胞,不同抗性愈伤插入nptII基因拷贝数不同,nptII酶活性不同。McCabe等(1988)以大豆芽分生组织为靶组织,经基因枪轰击获得转基因大豆,获得了转基因植株,但都为嵌合体。Sato等以大豆组织的不同部位(未成熟胚的芽尖和长期增殖悬浮培养物)为靶组织进行基因枪轰击,GUS染