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微波萃取连钱草中总三酸的工艺研究 连草是嘴唇科多年生草本植物的活血丹（nakai）kpr干燥区域，主要产于江苏省和浙江省。有利湿通淋,清热解毒,散瘀消肿等功效。现代医学表明,连钱草具有治疗胆固醇结石及抗炎作用。据有关文献报道连钱草中主要含有黄酮和三萜酸类成分,如齐墩果酸、熊果酸等。目前连钱草中总黄酮的提取方法报导较多,而总三萜酸的提取工艺较为匮乏。本实验采用微波萃取法提取连钱草中总三萜酸成分,并与传统醇回流法相比较,得到了比较满意的结论。 笔者就微波萃取法提取连钱草中总三萜酸类成分,进行了最佳工艺条件探索,同时与传统的醇提取法进行了比较,结果微波萃取法的结果更令人满意。 1 材料和机器 1.1 仪器和检测方法 高速万能粉碎机(泰斯特仪器有限公司,天津);CW-2008微波萃取仪(新拓分析仪器科技有限公司,上海);TU-1901紫外分光光度计(普析通用仪器有限责任公司,北京);RE-2000旋转蒸发仪(亚荣生化仪器厂,上海)。 1.2 浙江医学研究 熊果酸对照品(中国药品生物制品鉴定所);连钱草(浙江中医药大学第二门诊部提供,经浙江医学高等专科学校邓茂芳副教授鉴定);高氯酸、冰醋酸、香草醛、无水乙醇均为分析纯。 2 方法和结果 2.1 标准曲线的生产 2.1.1 熊乳酸储备液0. 精密称取熊果酸对照品10 mg(实际为9.8 mg),置100 mL量瓶中,加无水乙醇溶解后,定容至刻度,摇匀,即得熊果酸储备液(0.098 mg / mL)。 2.1.2 熊乳酸总总糖含量测定 分别精密量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL熊果酸储备液,水浴挥干,分别加5%香草醛-冰醋酸液0.4 mL、高氯酸0.8 mL,置60℃水浴加热10 min,冰浴冷却后,加冰醋酸5.0 mL摇匀,用紫外分光光度法在546 nm处测定其吸光度。 2.1.3 标准曲线的绘制 以熊果酸含量(mg)为横坐标,吸光度为纵坐标,得到标准曲线,其回归方程为:y=6.0117x+0.0933,r=0.9995,线性范围为0.020～0.140 mg/mL。 2.2 正交表设计 选用微波萃取-醇提法,拟定4个因素(溶剂浓度,固液比,提取温度,提取时间),各取3个水平,拟定L9(34)正交表设计实验,见表1。 2.3 黄酮类成分的萃取 取干燥药材粉末10 g,置提取器中,分别按正交设计的实验条件萃取黄酮类成分,微波强度为50%。经微波萃取后,过滤,滤液回收乙醇,残留物用50%乙醇溶解,定容至50 mL,摇匀,备用。 2.4 测定总三酸含量在连钱草中的含量 分别吸取上述各样品溶液0.4 mL,按2.1.2项方法显色,于546 nm处测定其吸光度,测定总三萜酸成分在连钱草中的含量,结果见表2。 2.5 结果分析 2.5.1 进行误差分析 研究结果以测定总三萜酸成分含量为优选正交方案的考察指标,进行极差分析,见表3。极差R值大小显示,各因素作用主次为ACDB,最佳工艺为A2B1C2D3,即用50%的乙醇8倍量,于70℃提取10min。 2.5.2 分散分析 将正交试验结果进行方差分析,结果见表4。可知相对于B因素,A因素有显著性意义。 2.6 最佳工艺验证 取连钱草粗粉,按最佳工艺条件提取样品,重复试验5次,结果见表5,提取率的平均值为0.940%,RSD=1.25%(n=5)。 2.7 返回率测试 精密称取已知含量的样品,准确加入熊果酸对照品进行测定分析,得平均回收率为99.58%,RSD=2.03%。结果见表6。 2.8 连钱草草总三酸含量的测定 称取干燥药材粉末10g,按上述最佳乙醇浓度和配液比,即加入400mL 50%的乙醇,于70℃回流提取2h,过滤,同法再操作一次,合并提取液,过滤,回收乙醇,残留物用50%乙醇溶解,定容至50 mL,按2.4项下方法测定含量,计算得连钱草草总三萜酸含量为0.647%。微波萃取法与之相比,提取效率高45.3%。如图1所示,且使用微波萃取所用时间短,效率高,损失小。 3 微波萃取法与传统乙醇回流法比较 本次实验通过正交分析,得到了微波萃取连钱草总三萜酸的最佳工艺,即:50%的乙醇8倍量,于70℃提取10min。几个影响因素中,溶剂的浓度对结果影响最大,其次是提取时间和提取温度,固液比对结果的影响不大,可以根据实际条件选择。 微波萃取法是一种新型的提取方法,具有设备简单、萃取范围广、提取效率高、重现性好、节省时间、节省试剂、污染小等特点。在与传统乙醇回流法比较中,无论在提取时间、溶剂消耗还是提取效率方面,都有非常明显的优势。该条件下各指标含量较高,说明提取较完全,经过重复性实验验证,该方法稳定性好,工艺可行。