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烟草细胞悬浮培养体系的建立 集体培训不仅是快速植物育种的一种手段，也是植物改良、物种保存和二次材料生产的一种理想方式。有关烟草组织和细胞培养已有不少报道,近年来在抗性研究、基因转化和次生物质生产等方面也取得一些进展。有研究表明,以植物悬浮培养细胞为材料生产次生代谢物具有培养周期短、材料均一、重复性好等优点。烟草中含有大量次生代谢物,因此,建立稳定而具有高活力的烟草悬浮培养细胞体系对次生代谢物的生产有重要意义。到目前在白肋烟的愈伤组织培养和细胞悬浮培养方面的研究报道较少。本试验以白肋烟鄂烟1号的叶为材料进行了愈伤组织的诱导,确定获得脆散性愈伤组织的最佳激素配比,并以此为基础建立起烟草细胞悬浮培养体系,旨在为烟草中次生物质的生物开发利用提供依据。 1 材料和方法 1.1 试验材料 鄂烟1号烟草种子,由郑州烟草研究院提供。 1.2 测试方法 1.2.1 种子幼苗的制备 将烟草种子用70%酒精浸泡1 min,10% NaClO消毒10 min,经无菌水漂洗后接种于无激素的MS固体培养基,28 ℃下暗培养,之后将未污染的发芽种子转接到MS0固体培养基上,于28 ℃下光照培养16 h,得无菌种子幼苗。 1.2.2 加有激素的基本培养基 取无菌苗叶片外植体,切成5 mm×5 mm的小块,接种在加有激素的3种基本培养基上,各处理见表1。28 ℃下暗培养,15 d后得到初始愈伤组织。 1.2.3 培养叶片的激素配比 在基本培养基筛选的基础上,筛选出最优基本培养基为MS培养基,其对激素配比做进一步的调整细化,见表2,选取长势较好的愈伤组织继代培养,筛选最佳生长培养基。 1.2.4 脆散性损伤 按已确定的生长培养基配方配制固体生长培养基,选择长势较好、黄白色的愈伤组织进行继代,28℃下暗培养,第4代后获得脆散性愈伤组织。 1.2.5 愈伤组织的生物干重百分率测定 按已确定的最优生长培养基配方配制固体培养基,灭菌分装于三角瓶中。将切好的脆散性愈伤组织称重后接种于编号的三角瓶中,记录m1;于28 ℃下暗培养,每2 d取样1次,每次取样3瓶,称取愈伤组织鲜重,记录m2;将愈伤组织烘干至恒重,称重记录m3。每次取样的愈伤组织鲜重与干重倍增值的计算方法: 愈伤组织鲜重倍增值F=m2/m1 愈伤组织干重倍增值D=m3/(m1·1.5%) 式中:1.5%为接种愈伤组织的生物干重百分率。 依据愈伤组织鲜重与干重倍增值的平均值绘制生长曲线。 1.2.6 犯罪人员的培养 按已确定的生长培养基配方配制液体生长培养基,将疏松愈伤组织用玻璃棒碾碎,每瓶加入一定量的愈伤组织,pH值为5.7~5.8,28 ℃下摇床暗培养,摇床转速110 rpm。 2 结果与讨论 2.1 愈伤组织的诱导 将烟草外植体接种到基本培养基上,28 ℃下暗培养15 d,观察外植体生长分化的情况,获得一系列不同分化程度的烟草愈伤组织,见表3。 由表3可见,3种基本培养基中激素组合NAA+6-BA的烟草愈伤组织诱导率优于2,4-D+KT,NT基本培养基上烟草愈伤组织的诱导率很低。MS培养基的各种处理诱导出愈伤组织最快,约6~8d;B5基本培养基约为10~12 d;在NT基本培养基上的诱导时间较长,约35~40 d,而且外植体的死亡率也比MS和B5基本培养基高。因此NT培养基不适合本实验材料愈伤组织的诱导。在MS培养基和B5培养基上,加2,4-D激素虽然有抑制芽分化的作用,但是浓度高于1.0 mg/L时会使愈伤组织变黑,对细胞生长不利。MS培养基上,MS3(NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)的效果最好,烟草胚性愈伤组织的诱导率较高,没有褐化,MS4(NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L)次之,MS1(2,4-D 3.0 mg/L+KT 0.2 mg/L)褐化严重;B5基本培养基上,B53(NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)的效果最好,B54(NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L)次之。可见,3种培养基中MS基本培养基适合本实验材料外植体的诱导。 2.2 培养基配方的筛选 在基本培养基中选择烟草细胞脱分化程度高、生长快的培养基配方MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L、MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L和MS+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L,以此为基础对激素配比作进一步的调整(表2),选择长势较好,淡黄色的愈伤组织切成小块,接种到新鲜的培养基上。28℃下暗培养15 d,观察结果见表4。 由表4可以看出:2,4-D和KT组合中,KT浓度一定时,2,4-D比例越大,愈伤组织褐化有加重的趋势;2,4-D 一定时,KT比例越大,愈伤组织分化程度越高。并且该组合愈伤组织生长较慢,体积