解淀粉芽孢杆菌ba33菌株的分离与鉴定.docxVIP

解淀粉芽孢杆菌ba33菌株的分离与鉴定 根据研究，植物根周围的有益微生物具有抑制病原体和促生作用，颗粒酪氨酸酶是一种重要的植物根周围刺激细菌。土壤中解淀粉芽孢杆菌能分泌多种抗菌蛋白、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)及伊枯草菌素A(iturin),对多种植物病原菌有直接抑制作用。此外,解淀粉芽孢杆菌还能促进植物生长,抑制烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、黄瓜花叶病毒(CMV)的侵染。Idriss 等报道解淀粉芽孢杆菌 FZB45具有肌醇六磷酸酶(phytase)活性,可以在缺磷的条件下刺激植物生长。 本实验室(农业部烟草类作物质量控制重点开放实验室)从烟田土壤中分离到1株生防菌Ba33菌株,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌。用烟草花叶病毒(TMV)的枯斑寄主三生NN烟(Nicotiana tabacumvar.samsumNN)进行摩擦接种法生物测定,发现Ba33发酵液对TMV有较好的体外钝化作用,并纯化获得分子量为27 kD的蛋白,对TMV的钝化作用为85.35%,电镜下观察其可引起TMV粒体聚集断裂。本试验以普通烟(Nicotiana tabacum)NC89为材料,在接种TMV前后用Ba33发酵液对烟苗连续灌根,调查烟株生长势,并用实时荧光定量PCR检测了新叶中RNA含量,进一步明确Ba33对烟株有促生及抗TMV作用。 1 材料和方法 1.1 培养基nb 解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)Ba33发酵液及发酵培养基NB(牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、蔗糖10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL),普通烟NC89;TMV枯斑寄主三生NN烟(Nicotiana tabacumvar.samsumNN),保存在NC89上的TMV活体毒源。 1.2 实验仪器及方法 实时荧光定量PCR反应采用TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司试剂。试验仪器为TaKaRa公司的Thermal Cycler Dice PCR仪、APPlied Biosystems 7500 Real Time PCR 系统及Alpha Innotech Alphalmager凝胶成像系统。 1.3 烟草内在基因检测 根据已报道的TMV基因序列,设计并合成CP基因引物F1:5′-ATTAGACCCGCTAGTCACAG CAC-3′, R1:5′-GTGGGGTTCGCCTGATTTT-3′,扩增片段84 bp;烟草内参(看家)Actin基因引物F2:5′-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3′,R2:5′-AAGGGAT GCGAGGATGGA-3′,扩增片段105 bp。引物由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司合成。 1.4 测试方法 1.4.1 接种tmv 选择生长势一致的5叶期三生NN烟苗,间隔2 d 连续喷施Ba33发酵液3次,每株上部2片叶摩擦接种TMV,每处理3株,3次重复,以喷清水和NB培养基为对照。接种4 d后调查接种叶枯斑数,用每处理接种叶平均枯斑数计算枯斑抑制率。 1.4.2 ba33发酵溶液对普通烟lc9有促进生长和抗mtv作用 (1) 发酵液、培养基nb灌根 4~5叶期的NC89烟苗移栽后缓苗3 d,接种TMV 6 h后,分别用清水、Ba33发酵液、培养基NB灌根,每株10 mL,再连续灌根2次,每次间隔3 d,每处理7株,3次重复。接种后10 d,测量烟苗的全株平均鲜重及最大叶长、叶宽,取新叶采用实时荧光定量PCR法检测RNA含量。 (2) 灌根、接种及接种 4~5叶期的NC89烟苗移栽时分别用清水、Ba33发酵液、培养基NB灌根,每株10 mL,再连续灌根2次,每次间隔5 d,每处理7株,3次重复。末次灌根5 d后,测量烟苗的全株平均鲜重及最大叶长宽,并接种TMV,接种10 d后取新叶检测RNA含量。 数据采用邓肯氏新复极差法(DMRT)进行差异显著性检验。 1.4.3 检测cp和actin的表达 以Biozol提取烟叶总RNA。分别以CP-R1和Actin-R2为引物配制反转录体系,合成cDNA。将合成的cDNA按30~35稀释6个浓度。实时荧光定量PCR 反应体系: cDNA 1 μL, 2倍SYBR PremixEx TaqTMBuffer 12.5 μL,正反向引物各0.5 μL,ROX Reference Dye 0.5 μL,dH2O补至25 μL,3次重复。反应参数:95℃ 10 s;95℃ 10 s,65℃ 5 s,40个循环;62℃ 32 s。获得CP和Actin的扩增曲线、标准曲线和熔解曲线。 取接种TMV 10 d后的新叶0.1 g,以1 mL Biozol提取总RNA,2次重复。实时荧光定量PCR反应获得扩增曲线,将Ct值代入标准曲线