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分子标记在茶树品种鉴定中的应用 目前，茶叶品种的真实性主要体现在形态特征和其他外观上，但形态特征容易受到环境条件、栽培措施和发育水平的影响。可靠性低，需要专家的长期经验，以及低可用性。所以开发稳定可靠、易于操作的茶树品种鉴定技术迫在眉睫。分子标记技术是以DNA的多态性为基础的遗传标记,可以从基因组层面对品种进行快速、准确、不受外界环境条件影响的鉴定,已成为品种质量监控和真假鉴定的重要技术措施。作为分子标记类型之一的SSR标记,由于其具有共显性、重复性好、多态性高以及操作简单的特点,成为目前应用最广泛的分子标记类型,已经成功应用于多种农作物品种的鉴定上,茶树上也有相关的研究报道,为今后茶树品种鉴定提供了新的技术条件。 叶色突变茶树品种是一类特异的茶树品种,以白叶1号(安吉白茶)、中黄1号、黄金芽等品种为代表,其新梢白化或黄化,所制茶叶成品具备外形独特、口感鲜爽等特异的特征,深受消费者青睐。因其种植经济效益高,所以茶农种植的积极性较高,导致苗木价格也非常高。于是假冒苗木经常出现,损害了育种者和种植者的利益,也对新品种的推广造成了极大地困扰。为了更好地保护育种者和种植者的利益,打击假冒品种的行为,笔者选取了当前推广面积较大的几个叶色突变品种,构建了相应品种的分子指纹图谱和分子身份证,以期为保护育种者和消费者的合法权益提供依据。 一、 材料和方法 1. 从福鼎白茶、药物为对照 供试材料为中黄1号、中黄2号、安吉白茶、黄金芽、黄金菊、白鸡冠等6个叶色突变品种,并以正常绿色品种福鼎大白茶和龙井43为对照(表1)。上述材料均来源于中国农业科学院茶叶研究所国家种质杭州茶树圃,选取完整、无病虫害的一芽二叶,经液氮处理后于-80℃冰箱中保存备用。 2. 方法 (1) 微量核酸检测 采用植物基因组快速提取试剂盒(TIANGEN)提取茶树基因组DNA,用NanoDrop ND-1000微量核酸蛋白测定仪(Pittsburgh,PA,USA)测定DNA的浓度和纯度,1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。将产物稀释至10ng/μL后于-20℃保存备用。 (2) sr索引 从本实验室开发的茶树EST-SSR系列引物中选择(引物信息见表2)。 (3) pcr扩增及电泳 PCR扩增反应体系为:总体积10uL,其中ddH2O 5.5μL,10×PCR Buffer 1.0μL,2.5mM dNTP 0.2μL,primers各0.8μL,Taq polymerase 0.2μL,DNA 1.5μL。扩增程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环;最后72℃延伸10min,于4℃保存。PCR产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶在C.B.S MGV-210-33型电泳仪上进行电泳,电泳缓冲液为1×TBE,于180V电泳70min左右。电泳结束后参照Charters(2000)的方法进行银染显色,并拍照保存。 3. 茶树多态性基因信息分析 采用人工读带的方法,只分析有目标条带且可以分辨的位点。目标条带按大小依次记为“A”、“B”、“C”等,有几条等位基因就用几个字母表示。对于二倍体的茶树而言,一条带表示纯合,记为“AA”等,两条带表示杂合,记为“AB”等。利用PowerMarker统计每个标记在8个茶树品种中检测到的等位基因数(Na),基因型数(Genotype)、多态性信息量(PIC);采用Popgene软件计算等位基因频率(Allele frequency)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He),并获得遗传距离(genetic distance)和相似系数矩阵；根据Nei氏遗传距离,按非加权类平均法(UPGMA)进行聚类,绘制树状聚类图。 二、 结果与分析 1. 参试材料等位基因信息分析 利用10对EST-SSR引物对8个茶树品种进行PCR扩增,结果显示所有引物都能扩增出清晰的条带,且均表现出多态性(表2)。10对引物共扩增出等位基因29个,每对引物扩增出的等位基因数变幅为2～5个;基因型数最多为6个(1696),最少为2个(1052、3011、4048),平均每对引物扩增出的基因型数为3.6个;参试材料PIC变化范围较大,其中最小的仅为0.117 (4048),最大的为0.727(1696),平均值为0.423,其中大于0.5的只有3对引物;引物Ho最小值为0.000 (3011),最大值为0.625 (1633),平均值为0.288;He最小值为0.125 (4048),最大值为0.775 (1696),平均值为0.452 (表3)。 2. 等位基因b 引物4048扩增出的等位基因B出现频率最高,为93.8%,其次为3011 (87.5%),1052的等位基因A和5110的等位基因B均为81.3%。等位基因出现