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苯酚-硫酸法测定葡萄酒中多糖的优化研究 葡萄糖是葡萄酒的主要成分之一，与葡萄酒的澄清密切相关。葡萄酒中的多糖主要来源于葡萄果实、酵母以及侵染葡萄果实的灰霉菌。但对于葡萄酒的稳定性来说,不同类型的多糖具有不同的作用。它们被认为是“保护性胶体”,有防止或限制聚合、絮凝、浑浊和酒石酸盐结晶的作用,同时也会提高葡萄酒的浑浊度。多糖对葡萄酒的感官品质也起着重要的作用。 多糖的定量测定方法有很多,常用的显色法有以下3种:地衣酚-盐酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法,其中地衣酚-盐酸法应用并不广泛,蒽酮-硫酸法不稳定,重现性也不好,因此本实验室选择重现性较好的苯酚-硫酸法作为多糖定量的方法。苯酚-硫酸比色法测定多糖含量是由Dubois等提出的,苯酚-硫酸试剂不仅可以与多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应,还可与游离的寡糖进行显色。己糖在490nm处有最大吸收值,吸收值与糖含量呈线性关系。此法操作简单、快速、灵敏、重复性好,对每种糖仅需制作一条标准曲线。不过其结果也受标准糖种类的影响。 用苯酚-硫酸法检测葡萄酒中多糖含量,迄今未见有相关的报道。从该法在其他物质的应用结果来看,其准确性和精确度受多种因素的影响,其中最主要的几个因素有苯酚和浓硫酸的用量、反应温度(水浴加热温度)和反应时间(水浴加热时间)。通常将这4个因素用正交试验的方法来确定最佳测定条件。还要减少色素、单糖等干扰物质对苯酚-硫酸法的影响。 本研究是在前人研究成果的基础上,改进苯酚-硫酸法,建立适用于葡萄酒体系的多糖含量测定方法,为葡萄酒中多糖的定量检测奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 产年份2006-2 本实验选取瓶装赤霞珠葡萄酒样品29个,生产年份为2006-2 0 0 9,其中2 1个出现浑浊或沉淀,另8个为澄清状态。用于方法建立的葡萄酒为出现浑浊的1款葡萄酒。 1.1.2 半乳液标准制备 称取干燥(105℃,6h)至恒重的半乳糖标准品37.5mg,置25m L容量瓶中定容。然后将此溶液再稀释为0.3mg/m L。 1.1.3 %苯酚试剂的制备 酚见光或遇氧即逐渐氧化成淡红色,因此应现配现用。将重蒸酚置于热浴水中,使其溶解为液体,然后用移液管精密吸取5m L置于100m L容量瓶中,用去离子水定容,即得到5%苯酚试剂。苯酚有强烈的腐蚀性和刺激性气味,操作时应戴上胶皮手套,动作迅速、小心,尽量在通风橱中完成。 1.1.4 其他试剂 浓硫酸为优级纯,无水乙醇为分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 葡萄酒中醇沉淀的提取 乙醇沉淀法获得葡萄酒粗多糖:澄清葡萄酒和浑浊葡萄酒都含有多糖,为比较葡萄酒中多糖含量的差异,我们采用乙醇沉淀法将葡萄酒中的多糖等大分子物质沉淀下来,以制得葡萄酒多糖粗提液。具体做法如下:取300m L葡萄酒与无水乙醇以1∶3.5比例混合,使葡萄酒中乙醇的终浓度达到约80%,然后放于4℃冰箱中静置24h,接着在6000r/min下离心10min,倒去上清液,这样分多次离心收集沉淀,并用无水乙醇将沉淀洗涤两次,以去除沉淀物中醇溶性的小分子单糖和寡糖等。离心,将沉淀收集于干净的离心管中,保存在-40℃冰箱里待用。 葡萄酒多糖样品液的制备:将从葡萄酒中收集的粗多糖溶于25m L去离子水,室温下振荡提取12h,在6000r/min下离心10min,取上清液于干净离心管中,再从中吸取5m L定容在25m L容量瓶中,配制成样品液。 1.2.2 浓硫酸加入量的确定 苯酚-硫酸测定多糖方法:吸取0.3m L多糖样品液,加入适量5%苯酚溶液和浓硫酸后进行显色反应,在520nm下测定其吸光值(A),通过与标准曲线对比确定葡萄酒中的多糖含量。 苯酚与浓硫酸的用量:苯酚和浓硫酸的用量不能单独确定,而需确定它们反应最充分、最稳定时的用量比例。首先确定加入浓硫酸含量是5m L,分别吸取样品液和对照液0.3m L5份,各加入5%苯酚液0.4m L,0.6m L,0.8 m L,1.0 m L,1.2 m L加水至2.0m L,再各滴加浓硫酸5.0m L,3 0℃恒温2 0 m i n后,测其A值;若从苯酚液加入量达到某一值开始,A值基本保持不变,则说明苯酚液量达到该值时,反应达到充分状态,该苯酚液量与浓硫酸的比值最为合适。 水浴温度与时间:分别吸取样品溶液0.2m L加水到1m L于2个具塞试管中,各加5%苯酚液1.0m L,再加入浓硫酸5.0m L。一份于水浴中煮沸15min,另外一份在室温下静置15min。平行试验3次。取出,冷却至室温,15min后于490nm处测其A值,选取A较高的作为实验温度。 硫酸的添加方式:本实验中,设定了3种加入浓硫酸的方式,分别为:室温下缓慢加入、在冰水中缓慢加入和在室温下迅速加入。通过3种方式做出标准曲线来检验其精确性。 精密吸取0.3m