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药食两用挥发油的体外抗菌作用研究 随着消费者越来越重视食品的质量，高效、低毒天然食品腐败现象的提出和开发已成为各国食品研究的热点。许多植物挥发油由于其特殊的化学组成,在很多研究中表现出了很好的抗菌活性,成为新的特效低毒防腐剂的重要源泉。 丁香(Flos caryophylli)为桃金娘科植物丁香的干燥花蕾,其性辛温,丁香花蕾挥发油的主要成分为丁香酚(eugenol),具有消炎、杀菌、驱虫、镇痛等功效。肉桂(Cortex Cinnamomi)为樟科植物肉桂的干燥树皮,其性辛甘、大热,肉桂皮挥发油的主要成分为肉桂醛(cinnamaldehyde),具有抗菌、消炎、镇静、止痛等功效。丁香和肉桂均是我国卫生部公布的药食兼用植物材料,既能食用,又是名贵中药。有很多报道表明丁香和肉桂的挥发油有抑菌防腐作用,试验方法多是采用滤纸片法和倾注法,但滤纸片法受很多因素影响(如固体培养基表面水分含量及厚度等),使结果的不确定性增大;倾注法可在对大量EOs抗菌活性筛选时使用。为了考察液体环境下的抗菌活性,本实验采用微量肉汤稀释法进行抑菌试验,定量测定了丁香、肉桂及其主要成分丁香酚和肉桂醛的MIC,并与目前常用食品防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾的抗菌效果进行了对比,从而为天然植物防腐剂开发和应用提供更多理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 生物技术及其助剂 丁香(Flos caryophylli)、肉桂(Cortex Cinnamomi)北京市同仁堂药店;肉桂醛(cinnamaldehyde)、丁香酚(eugenol)Sigma公司;M-H琼脂(Mueller-Hinton Agar,MHA)、M-H肉汤(Mueller-Hinton Broth,MHB)北京奥博星生物技术责任有限公司;无水乙醇(色谱纯)天津市津科精细化工研究所;刃天青Sigma公司。 1.1.2 氢火焰离子分离器fid GC-14C气相色谱分析仪日本岛津公司(Shimadzu);氢火焰离子检测器(FID);DM-1701石英毛细弹性管柱(30m×0.25mm i.d.×0.25μm)迪马DIKMA公司;5μl微量进样器上海安亭微量进样器厂。 1.1.3 菌株和病毒种 金黄色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus)AS1.89、大肠杆菌(Escherichia coli)AS1.90、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AS1.1849、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)AS1.1174、志贺氏菌(Shigella dysenteriae)AS1.1869,以上菌种均购自中科院微生物所。 1.2 方法 1.2.1 挥发油的提取 分别对丁香和肉桂原料进行粉碎,各取粉末200g于5L的三口圆底烧瓶中,加入十倍量蒸馏水(M/V),浸泡1h,加热料液采用水蒸汽蒸馏法提取挥发油,蒸馏提取3 h以上,加热提取过程中随时收集挥发油,提取结束后,合并挥发油,用无水硫酸钠进行脱水后移入棕色样品瓶中,于4℃冰箱中保存备用。 1.2.2 相位测试 1.2.2. 流速 载气(N2):15.6ml/min;分流比:1:20;燃气(H2):45ml/min;助燃气(空气):450ml/min;尾气流速:40ml/m i n; 进样口温度:2 5 0℃;F I D检测器温度:2 5 0℃;进样量:1μl; (1)肉桂油程序升温:初始100℃,以4℃/min的速度升至150℃,保持3min,再以4℃/min的速度升至210℃,保持5min; (2)丁香油程序升温:初始100℃,以6℃/min的速度升至150℃,保持5min,再以4℃/min的速度升至210℃,保持5min。 1.2.2. 2.样品溶液的制备 以色谱纯乙醇为溶剂,准确配制样品溶液:丁香油溶液1020mg/L,肉桂油溶液475mg/L。 1.2.3 worm试验 1.2.3. %tween-80的蒸馏配制 分别取丁香和肉桂挥发油适量,用0.22μm的微孔过滤器过滤除菌,并用经灭菌处理的含1%Tween-80的蒸馏水配制成系列浓度药液:1 2 8 0 0、6 4 0 0、3 2 0 0、1600、800mg/L等; 分别用灭菌蒸馏水配制苯甲酸钠和山梨酸钾系列浓度药液:102400、51200、25600、12800、6400mg/L等。 1.2.3. 菌种活化与培养 将5种供试菌种分别接种于若干M-H琼脂斜面上,于37℃培养2 4 h,进行菌种活化。 活化后的细菌做十倍系列稀释,并活菌计数。用M-H肉汤将细菌分别配制成5×105CFU/ml浓度的细胞悬浮液。 1.2.3. mic抑制法 采用微量稀释法测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC