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佛手茎尖微嫁接技术研究 水生佛手柑属于四周科。它以干燥的水果为药物，具有平肝、理气、胃痛的功效。随着市场需求的扩大及产业化生产的发展,对佛手的产量和质量提出了更高的要求,需要在栽培管理、病虫害防治及优质种苗的培育等方面做好工作。笔者通过调查发现,影响佛手产量和质量的主要因素之一是病害的危害,尤其是佛手黄龙病。而且,由于佛手通常以扦插和嫁接繁殖,长期的无性繁殖,病原体逐代传递和积累,造成植株长势减弱、生活力下降、产量降低、品质变劣,严重威胁佛手的生产。运用现代生物技术培育无病原体苗,已成为佛手生产中极为迫切的问题。茎尖微嫁接技术可以脱除病原体,这项技术已在柑桔、沙田柚上获得成功,并逐步在生产上应用。本实验探讨了佛手茎尖微嫁接的方法并对影响嫁接成活率的因素进行研究,为佛手无病苗木的培育奠定基础。 1 材料和方法 1.1 rcodacylusswle和h-3s经营 感染黄龙病的佛手Citrus medicaL. var.sarcodactylis(Noot.) Swingle来源于广东省肇庆地区,通过电镜和PCR技术检测证明感染了黄龙病病原;砧木为柠檬C.limon(Linn.) Burm. f.实生苗。 1.2 方法 1.2.1 砧练习 取成熟柠檬果实中的种子,经表面消毒,剥去种皮,接种于MS培养基上,在培养箱中黑暗条件下培养,培养温度为28 ℃。 1.2.2 茎尖接穗的剥削法 采摘2~3 cm长的佛手病株嫩芽,切取0.5~1 cm茎尖,用蒸馏水冲洗几次,75%酒精浸泡约30 s,0.1% HgCl2消毒6 min,无菌水冲洗4~5次后,在双目显微镜下剥取0.2 mm左右的茎尖作为接穗(图1-A)。 1.2.3 叶、根、去顶、去顶、去顶 在无菌条件下,将砧木苗从培养瓶中移出,选择根茎部直径较大的健壮苗,切去子叶和部分过长的根并去顶,留约1.5 cm长的上胚轴(图1-B),在双目显微镜下,用自制的解剖刀在上胚轴上切成倒“T”字形切口,随后,将茎尖接到砧木的倒“T”字形切口上,根据实验要求分为外缠parafilm膜和不缠膜。 1.2.4 嫁接成活率测定 将嫁接苗移入带滤纸桥的液体培养基中,以MT为基本培养基,附加6-BA 0.1 mg/L和7.5%的蔗糖;培养温度为(26±1) ℃,每天光照12 h,光照强度为2 klx。观察嫁接苗的长势,一个月后记录嫁接成活率。一般每个实验处理,嫁接的苗数为20个左右。 2 结果与分析 2.1 茎尖微嫁接苗的萌发和移植 按照上述嫁接方法,在双目显微镜下,将切好的茎尖嫁接到砧木上胚轴的倒“T”字形切口上,外缠parafilm膜,再将整株移入带滤纸桥的液体培养基中。培养一周后,接穗和上胚轴切口处产生愈伤组织,嫁接苗开始成活。这时要及时除去砧木上长出的不定芽以减少对接穗萌发的影响;两周后,接穗开始萌生新叶,砧木也长出少量白色、幼嫩的新根;第3周,茎尖微嫁接苗长出6~8片真叶(图1-C),此时,将其从培养室中移出,在室内自然光下培养3 d,取出用蒸馏水洗净,置于5 mg/L IBA溶液中浸泡24 h后,单株移入混合土壤(50%的营养土∶50%细砂)的营养钵中,注意植株的保湿,移栽时应使根系紧密接触土壤,用1/2 MT培养液充分湿润土壤。一个月后,茎尖微嫁接成活苗可以长出10片左右新叶(图1-D)。 2.2 苗木苗龄对茎尖生长的影响 为了考察砧木苗龄对嫁接成活率的影响,取苗龄为8、10、12、14、16、18、20、22、26、32、36 d的实生苗为砧木,以带4个叶原基的佛手茎尖为接穗,分别进行微嫁接,并在嫁接切口外缠parafilm膜。可以看到,培养两周时,砧木苗龄在8~18 d的茎尖微嫁接苗长势良好,茎尖生长快,根系旺盛,长出许多白色、幼嫩的新根;随着砧木苗龄的增加,茎尖长势逐渐变差;而砧木苗龄为32~36 d的嫁接苗长势最差,茎尖生长缓慢,且逐渐萎蔫,根系变黄。一个月后统计成活率(图2),砧木苗龄为14 d,茎尖嫁接成活率最高,达60.0%;苗龄小于14 d的砧木,其嫁接成活率较低;但随着苗龄的增加,嫁接成活率也逐渐下降。当砧木苗龄为36 d时,嫁接成活率为0,说明砧木苗龄对嫁接成活率影响较大。由于苗龄为14 d时,砧木长势良好,苗径围度较粗,且尚未纤维化,切口易产生愈伤组织,有利于和接穗愈合;接穗通过砧木可以及时获得水分和营养,所以嫁接成活率较高。因此,以下试验均选取苗龄为14 d的柠檬实生苗为砧木。 2.3 叶原基的嫁接成活率 切取不同大小的茎尖,即无叶原基、带2个叶原基、带4个叶原基及带6个叶原基,分别进行微嫁接试验,切口外缠parafilm膜,结果见图3。可以看出,接穗大小直接影响嫁接成活率,带4个叶原基的茎尖嫁接成活率最高,达65.2%;6个叶原基的茎尖嫁接成活率有所降低,这可能是因为砧木