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基于高效液相色谱-二极管阵列检测器色谱图的地黄多波长指纹图谱及应用研究 地黄的抗剂量有很多种药物形式，其中黄色和白色的抗剂量非常高。熟地黄是生地黄经蒸制或加黄酒炖制而成。生地黄富含梓醇、水苏糖等有效成分, 性寒, 具有清热凉血等功效。熟地黄含5-羟甲基糠醛 (5-HMF) 等活性成分, 性微温, 具有滋阴补血的作用。这种药性的变化与加工过程中药材成分变化密切相关。研究表明地黄中梓醇、水苏糖等成分在熟地黄炮制过程中可能降解, 同时糖衍生物5-HMF大量产生, 使熟地黄向温性转变。由此可见熟地黄炮制过程中质量控制十分关键, 既要保证生地黄充分熟化, 又要使加工时间最短以节约能源。 高效液相色谱 (HPLC) 指纹图谱技术是被广泛认可的一种中药质量控制方法。但常用的单波长指纹图谱有时不能满足检测要求。在熟地黄指纹图谱建立常用的麦角甾苷检测波长334 nm及熟地黄检测成分5-HMF检测波长284 nm附近, 梓醇等环烯醚萜苷类成分并无吸收, 在此波长附近的指纹图谱不能显示这些成分, 并且在此波长下指纹图谱共有峰较少。而在梓醇检测波长205nm附近, 5-HMF吸收较小, 质量分数低的样品峰值小甚至无峰。地黄指纹图谱研究较早, 曾志等、李军等和贾玉梅等在280、334、215、230 nm波长下研究了生地黄、熟地黄和鲜地黄的HPLC指纹图谱。温学森等和曹建军等用示差折光检测器及在205 nm下研究了熟地黄加工过程中指纹图谱的变化。孙国祥等通过建立多波长指纹图谱采用均谱法、融合谱法等评价中成药质量。这些成果为本研究提供了参考。本实验采用多个波长下检测以获得较多的共有峰信息, 以便更精确地控制药材加工过程, 而二极管阵列检测器 (DAD) 为此方法提供了便利。 1 样品及试剂的制备 生地黄Rehmannia glutinosa Libosch产自河南武陟, 由笔者鉴定, 品级为4 级 (8~15 g) 。熟地黄对照品从购自各地的熟地黄样品中随机抽取, 来源见表1。 乙腈 (色谱纯) ;超纯水 (成都优普超纯水机制备) ;磷酸 (色谱纯, 天津科密欧) ;样品制备用甲醇 (分析纯, 西安化学试剂厂) ;梓醇 (批号110808-200508) 、麦角甾苷 (批号111530-200706) 对照品来自中国食品药品检定研究院;5-HMF对照品 (批号200805271, 上海晶纯试剂公司) , 质量分数大于98%。 2 方法 2.1 与标准多波长指纹检测指纹图谱的融合 本研究中地黄多波长指纹是指从多波长指纹图谱中提取的各共有峰峰面积值的集合, 即虚拟地黄。在生地黄加工成熟地黄过程中, 定时取样检测, 获得各加工时段的HPLC多波长指纹图谱, 各时段多波长指纹图谱与熟地黄标准多波长指纹 (随机抽取的熟地黄指纹的平均值) 进行比较, 相似性最大的时段即为加工的最佳时段。 多色谱指纹系统相似性计算之前通常把多个指纹图谱的数据进行融合, 考虑到多波长指纹图谱类似于电化学检测器产生的HPLC指纹图谱, 各波长指纹图谱是同一个样品在同一色谱条件下同时获得的, 只在检测波长上有所差异, 各波长指纹图谱的独立性较小。因此可以采用以下方法进行数据融合:样品各波长色谱中相同的共有峰按最大峰面积法选取, 直接进行数据合并, 建立多波长指纹。融合后的多波长指纹图谱峰面积标准化采用共有峰峰面积/总共有峰峰面积计算。相似性采用欧氏距离衡量, 欧氏距离越小相似性越大。本实验数据计算均在Excel软件下完成。 2.2 样品溶液制备 2.2.1 熟地黄炮制生地黄1.5 kg, 采用清蒸法炮制熟地黄, 炮制过程中每隔2 h取样1 次。 2.2.2 样品溶液制备精确称取0.500 0 g样品粉末, 置于50 m L量瓶中, 加入甲醇振荡后定容, 冷浸过夜后超声处理90 min。冷却至室温后加甲醇定容。摇匀, 滤过, 取续滤液25 m L旋转蒸干, 残渣用15%甲醇定容至5 m L。用0.22 μm微孔滤膜滤过后即可上样分析。 2.3 样品溶液配制 2.3.1 色谱条件采用Waters高效液相色谱仪, Waters 1525 二元梯度泵, Waters Sunfire C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) , Waters Sunfire C18保护柱 (4 mm×5 mm) , Waters 2996 二极管阵列检测器, Empower Pro色谱工作站。柱温35 ℃, 流动相为乙腈 (A) -0.02%磷酸水溶液 (B) , 线性梯度洗脱程序为0~5 min, 1% A;5~12 min, 1.5% A;12~17min, 3% A;17~50 min, 7% A;50~70 min, 9.5% A;70~90 min, 12.5% A;90~120 min