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基于1h-nmr和uplc技术的植物代谢组学分析 远志是中医学的一种常见植物，出现在汉代的《神农本草经》中。性温,味辛、苦,归心、肾、脾经,具安神益智、祛痰开窍、消散痈肿之功效。《雷公炮炙论》记载远志生品有“令人闷”的不良反应,并提出用甘草炮制,《得配本草》也指出远志“生用则刺激人咽喉”,因此远志临床上多使用炮制品。经考证,远志炮制方法可归纳为不加辅料的炒、焙、制炭等和加辅料的甘草制、蜜制、姜汁制、酒制和朱砂制等,根据应用目的不同而采用具体的炮制方法。据考证,蜜制能增强远志化痰止咳作用,而甘草制则减缓其“戟人咽喉”的燥性,协同增加远志补脾益气、安神益智之功效。临床多使用蜜远志(honey-stir-baked Polygalae Radix,HSB-PR)和甘草制远志(liquorice-stir-boiled Polygalae Radix,LSB-PR)。《中国药典》2010年版一部收录的远志炮制品为甘草制远志,说明蜜远志与甘草制远志为应用较广的远志炮制品。 生远志、蜜远志及甘草制远志化学成分的研究多集中在远志酸或远志皂苷元量的对比上,结果表明蜜制使远志皂苷元的量有所下降,甘草制则使其量上升。远志皂苷元是远志皂苷酸水解产物,《中国药典》2005年版以远志皂苷元为远志皂苷的定量测定对照品,但由于远志皂苷结构的特殊性,其酸水解产物不单一,因此以远志酸或远志皂苷元等酸水解产物为定量测定对照品不能准确评价远志总皂苷的量。而远志皂苷碱水解产物结构单一,水解产物为细叶远志皂苷,《中国药典》2010年版已将细叶远志皂苷作为远志总皂苷定量测定对照品,对于生远志、蜜远志及甘草制远志中细叶远志皂苷量的对比研究则尚未见报道。 远志化学成分较为复杂,以单一成分为指标无法全面评价远志质量,姜勇等基于HPLC指纹图谱技术结合相似度评价软件对远志不同部位及不同炮制品进行研究,发现蜜制品、甘草制品与生品的指纹图谱未发生明显改变,其认为炮制并不会改变远志中所含化学成分的结构。所采用的HPLC技术本身具有选择性,整体性不强,同时相似度评价软件侧重评价相似性,对于炮制引起的细小差异则无法看到,因此需要引入更加整体、更细微的评价方法评价远志生品及其炮制品的质量。 植物代谢组学技术是对植物提取物中代谢组进行无差别代谢成分全分析的高通量分析技术,从不同层面深入阐明初级及次生代谢产物,为中药质量控制打好基础。核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术由于其具有普适性,能够检测药材中所有含氢代谢产物,但在灵敏度上有一定的局限性,对质量分数较低且结构复杂的次级代谢产物分析能力较弱。而超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)技术具有较好的分离性能和较高的检测灵敏度,且分析时间短,有机溶剂用量少,检测成本低,方法灵敏、高效、准确,决定其可以有效地对植物中次级代谢产物进行快速、准确地分离鉴定。 因此,本实验采用基于1H-NMR和UPLC的植物代谢组学技术从整体角度对生远志、蜜远志和甘草制远志代谢组进行代谢组学研究,同时结合UPLC定量测定技术对其细叶远志皂苷的量进行考察,期望从新的角度为远志质量标准制定和传统炮制机制研究提供参考。 1 责任特性及样品采集 Bruker 600 MHz Avance III NMR Spectrometer(600.13 MHz质子频率,德国布鲁克公司600兆核磁仪),Waters Acquity UPLC H-Class(DAD检测器,Waters公司)。 重水(Norell,美国),氘代甲醇(99.8%,Merck,德国),氘代氢氧化钠(Armar,瑞士),3-三甲基硅基[2,2,3,3-d4]氘代丙酸钠(TSP,Cambridge Isotope Laboratories Inc.,MA),分析纯甲醇(北京化工厂),色谱纯乙腈、三氟乙酸、甲醇(Tedia,美国)。细叶远志皂苷为实验室自制,经HPLC峰面积归一化法测定其质量分数98%。 远志样品于2010年10月采自山西新绛及绛县远志种植基地,经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为远志Polygala tenuifolia Willd.(二年生)的鲜品,阴干、抽心后得生远志。蜜远志及甘草制远志为实验室自制,对新绛及绛县生远志进行蜜制和甘草制,得率分别为117%、100.7%。样品在60℃下干燥5 h,液氮研磨,过40目筛,保存备用。具体见表1。 2 方法 2.1 1h-nmr代谢组学技术分析 2.1.1 超声提取法 精密称取样品1、3、5粉末各200mg置10 m L玻璃离心管中,分别加3 m L蒸馏水及3 m L甲醇,加盖漩涡混匀1 min,超声提取25 min,以3 500 r/m