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湘黄鸡球虫病病原学调查 湖南黄鸡主要分布在湖南省南部。由于生长缓慢，生长缓慢，大部分采用地面繁殖和分散繁殖，因此其肉质细腻独特，深受消费者喜爱。然而，土壤保护很容易引起球虫病的多样性感染。胡永灵等报道湘南地区同一鸡群爆发多起球虫病。本病已成为危害当地养鸡业的重要疫病。 鸡球虫病是由艾美尔属球虫引起的鸡的肠道疾病。寄生于鸡肠道内的艾美耳球虫主要有7个种,分别是堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫。该病在我国大多数的养鸡场都有分布,该病分布广泛,危害大,尤其对雏鸡常常是毁灭性的,是严重危害养禽业的重要寄生虫病,在各种鸡病中,球虫病发病率最高,占1/6～1/5 。 为弄清湘黄鸡球虫病病原学流行情况,选择湘黄鸡饲养集中的五个县(区)的5个养鸡场,将所调查鸡群的粪样分段采集,用琼脂薄板进行单卵囊的分离培养和球虫单卵囊感染试验,按照鸡球虫种类鉴定标准鉴定虫种。以期望为当地正确地预防和治疗湘黄鸡球虫病提供重要的参考依据。 1 材料表面 1.1 人工养鸡场的选择 选择湘黄鸡饲养较集中的沿湘江流域的衡东,衡山,衡南,衡阳县,衡阳市郊区五个县区5个专业养鸡户,全部采用地面散养方式,其中选择在山坡饲养鸡场2个,平地饲养鸡场3个。现场采集养鸡户鸡场的新鲜粪便。 1.2 试剂 2.5%重铬酸钾溶液、饱和盐水、琼脂、生理盐水、甘油、白糖、巴氏消毒液等。 1.3 网石 采用检查寄生虫虫卵常用的金属筛,尼龙筛网兜、平皿、显微镜、冰箱、离心机、纸箱、刀片、酒精灯、载玻片、毛细吸管、青霉素瓶、火柴,带盖的塑料瓶5个,筷子5双等。 1.4 饲料的消毒使用 本实验所用的雏鸡为刚出壳的湘黄鸡,置于严格消毒的隔离笼内用不含任何抗球虫药的饲料饲喂,感染前采用饱和盐水漂浮法检查其粪便卵囊为阴性者方可使用。 2 方法 2.1 带血粪便的带血粪 用高温消毒的筷子和500 mL带盖的塑料瓶,在上述五个鸡场的垫料上各采集15～25堆球虫病病鸡的新鲜带血粪便,瓶内盛100 mL 2.5%的重铬酸钾溶液。填写标签,置于纸箱中,带回实验室。 2.2 盐水的制备 将带回的新鲜粪便,倒入塑料桶或搪瓷盆中,按常规方法分离出球虫卵囊。加入鸡粪10～15倍量的饱和盐水,用玻璃棒充分搅拌均匀,静置30～60 min,鸡球虫则漂浮于饱和盐水的表面。将含有球虫卵囊的饱和盐水上层液倒入50目金属筛过滤,球虫卵囊经金属筛滤入下层的260目尼筛网兜内,再用蒸馏水反复冲洗干净,把尼龙筛网兜内的球虫卵囊倒入平皿内,加入适量的2.5%重铬酸钾溶液,置29℃恒温箱中培养。 2.3 单囊繁殖 2.3.1 大玻璃板大玻璃板法 此方法是根据林青,于三科等的方法进行改进。具体操作为将2 g琼脂粉倒入100 mL小烧怀中,加水49 mL,加白糖1.5 g,用水浴加热到60～70℃,使琼脂完全溶解即成。每次将此琼脂溶液2 mL滴于干燥洁净的载玻片上,厚度约为1.5 mm,4℃冰箱放置30 min,另准备一块大玻璃板,涂上甘油,将玻片上的琼脂片转移至大玻璃板上,于4℃冰箱冻干一天即可,该薄板可用于单卵囊包被。将一支的玻璃管在酒精灯上一头拉成一支小的毛细吸管,另一头装上橡皮吸头。 2.3.2 小球卵囊的制备 将上述5个球虫卵囊样品用吸管吸取5滴于一试管内,加入生理盐水稀释至在显微镜低倍镜下每个视野只有1～2个球虫卵囊为止。用小毛细吸管在显微镜下吸取一个卵囊后将其吹落到有琼脂的载玻片上。用双面刀片将此琼脂轻轻切割成约2～4×4 mm的小方块,再用琼脂片将单个卵囊包埋起来。每一个样品制备10个形状与大小尽量不一的琼脂球虫单卵囊作为雏鸡球虫单卵囊感染试验用。 2.4 球虫感染成功率 雏鸡分组:将分离出来的球虫卵囊在显微镜下根据其形态结构基本上可分为五种不同种类的球虫,然后挑选个体大小基本一致的实验用的雏鸡60只,编号、登记后随机分为6组,每组10只,1～5组分别感染5种不同形态的球虫,第6组作为空白对照,不进行感染。5组进行感染的鸡,其感染成功率各不相同,具体数目详见表1。 感染方法:将包埋了鸡球虫单个卵囊的琼脂经口感染雏鸡,试验鸡饲喂经消毒的不含抗球虫药的配合饲料和凉开水。 2.5 鸡球昆虫的鉴定标准 用最短潜在前期,最短孢子化时间,寄生部位, 球虫卵囊形态与大小来确定球虫种类。 2.5.1 潜在初始测量 每一组鸡从感染72 h后开始,每2 h检查一次粪便,观察并记录试验鸡粪便中出现第一个球虫卵囊的时间,详见表2。 2.5.2 重铬酸钾培养 分别收集每组鸡最新鲜粪便于平皿中,加入少量2.5%重铬酸钾,置25～29℃恒温箱中培养。6 h后每小时检查并记录出现第一个孢子化卵囊需要的时间详见表3。 2.5.3 寄生虫部位 感染7 d后分组剖杀,把鸡的肠道分成小肠前段,