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h2s对尿源性脓毒血症肾损伤的影响及其机制 在尿源性败血症（uor-mei）中，肾也是最易受损的重要器官之一。研究发现Na HS (H2S的供体) 可抑制脂多糖对血管内皮细胞的炎症反应, H2S可对抗脓毒血症诱发的急性肺损伤及其炎症反应。核因子 (NF) -κB在脓毒血症器官衰竭中发挥重要的作用, 其参与多种与感染性免疫应答相关的基因调节。H2S可抑制NF-κB信号通路, 对NF-κB的表达与活性具有重要的调控作用。H2S能否通过抑制NF-κB的表达, 减轻尿源性脓毒血症肾损伤目前尚少见报道。本研究通过模拟上尿路急性梗阻注入大肠杆菌建立兔上尿路感染致脓毒血症模型, 观察H2S对尿源性脓毒血症所致肾损害的作用及对肾组织NF-κB表达的影响, 以揭示H2S抗尿源性脓毒血症肾损害作用的机制。 1 肾组织病理学检测 1.1 动物及试剂雄性新西兰大白兔30 只, 体质量1.80~2.20 kg (购自南华大学动物学部) , 实验中以颗粒饲料及自来水喂养, 严格遵行南华大学《动物实验伦理准则》。大肠杆菌 (ATCC 25922) 由南华大学附二医院微生物室提供;Na HS (Sigma公司) ;肿瘤坏死因子 (TNF) -α抗体、白细胞介素 (IL) -10抗体、NF-κB抗体 (北京博奥森公司) ;兔SP-HRP试剂盒与DAB显色试剂盒 (北京康为世纪生物科技有限公司) 。 1.2 方法 1.2.1 尿源性脓毒血症动物模型的建立将30只大白兔按随机数字表法分为Control组、Sham组、Sepsis组、Na HS 2.8μmol/kg组和Na HS 8.4 μmol/kg组5 组, 每组6 只。Control组以正常颗粒饲料及自来水喂养, 不做任何处理。Sham组兔称体质量后用10%水合氯醛 (3 m L/kg) 腹腔注射, 麻醉满意后, 取左下腹腹直肌旁切口, 打开腹腔, 分离左输尿管中段, 肠管复位后关闭切口。Sepsis组分离并结扎左输尿管中段, 将0.5 m L/kg、108/m L浓度大肠杆菌悬液 (ATCC 25922) 注入输尿管管腔内。Na HS 2.8 μmol/kg组及Na HS 8.4 μmol/kg组实验操作同Sepsis组, 术后分别经耳缘静脉注射浓度为50mmol/L的Na HS溶液2.8 μmol/kg及8.4 μmol/kg, 术后正常颗粒饲料及自来水喂养。术后72 h处死兔子, 取左侧肾脏。 1.2.2 血常规、肾功能的检测于术前、术后24 h、术后48 h、术后72 h采血行血白细胞计数 (WBC) 分析;取静脉血5 m L离心 (3 000 r/min, 10 min) 取上清液, 用AU800 全自动生化仪 (奥林巴斯) 检测血肌酐 (Cr) 、尿素氮 (BUN) 。 1.2.3 肾组织HE染色术后72 h取适量肾组织以10%福尔马林固定、包埋, 制作好病理切片。将石蜡切片脱蜡去水、苏木素染色、分化和蓝化、伊红染色、洗涤、脱水、透明, 封片。光镜下观察并摄片。 1.2.4 肾组织透射电子显微镜观察病理变化术后72 h将肾组织固定、漂洗、脱水、浸泡、烘烤、包埋、修块、半薄切片定位、超薄切片 (厚约50 nm) 、双重染色、电镜 (日立Hitachi-7500) 下观察并拍照。 1.2.5 免疫组织化学法检测肾脏组织中TNF-α、IL-10、NF-κB蛋白的表达石蜡切片常规脱蜡、水化;抗原修复, 3%过氧化氢清除内源性过氧化物酶活性, 加正常血清工作液, 室温孵育, 加一抗 (1∶300稀释) , 4 ℃孵育过夜, PBS淋洗后加生物素标记羊抗兔二抗, 室温孵育, PBS充分淋浴;加HRP标记的链霉亲和素, 室温孵育, PBS漂洗;加显色工作液显色 (DAB) ;苏木精复染, 脱水, 二甲苯透明, 封片。 1.2.6 去蛋白法测定血浆中H2S浓度术后72 h, 取血清样品0.1 m L, 依次加入1%乙酸锌0.5 m L、20 mmol/L N, N-二甲基-对苯二胺硫酸盐0.5 m L (溶于7.2 mol/L盐酸) 、30 mmol/L Fe Cl30.4 m L (溶于1.2 mol/L盐酸) 混匀, 室温静置20 min。加入10%三氯醋酸1 m L使蛋白沉淀, 加蒸馏水2.5 m L, 4 000r/min离心, 测定上清液在670 nm波长的吸光度, 以硫化钠制定标准曲线计算血清H2S水平 (μmol/L) 。 1.2.7 肾组织胱硫醚-γ-裂解酶 (CSE) 活性测定术后72 h取左肾组织在4 ℃的磷酸钾缓冲液 (50 mmol/L, p H 6.8) 中将肾组织研磨成10% (质量浓度, W/V) 匀浆, 低温离心, 取上清液。加入反应液5-磷酸吡哆醛/磷酸钾缓冲液 (0.5%,