费乌瑞它马铃薯茎尖培养及分化再生苗的脱毒研究.docx

费乌瑞它马铃薯茎尖培养及分化再生苗的脱毒研究 甘薯病毒和纺织锤头病毒（以下简称简称病毒）主要采用茎尖组织培养法，结合清热、低温处理法和抗病性药物法，提高脱毒效果。其中, 热处理结合茎尖组织培养法是一种应用较广的马铃薯脱毒方法, 在葡萄 (Vitis vinifera) 、草莓 (Fragaria×ananassa Duch.) 和苹果 (Malus pumila) 等植物上也有报道。但由于不同植物或同一植物不同品种基因型和生理特性的差异, 茎尖分化成苗的难易程度也不一样。以盖琼辉等、Iqbal等研究的马铃薯茎尖分化成苗培养基作为参考, 在同一培养基上对克新1号、夏波蒂、费乌瑞它、陇薯3号、布尔班克、青薯9号、早大白、冀张薯8号等品种的茎尖培养后发现, 这些品种茎尖分化成苗所需的最适培养基不尽相同, 其中, 费乌瑞它品种较难成苗, 夏波蒂品种最难成苗。费乌瑞它马铃薯是榆林地区近年来引进的优良品种之一, 该品种具有抗性强、产量高、品质优的特点。但随着种植年代的增加, 不同病毒或类病毒在块茎体内不断积累, 造成产量和品质逐年下降。因此, 及时、有效地控制病毒的传播是做好脱毒马铃薯产业的关键。目前, 国内关于费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗的文献报道较少。本研究针对费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗率较低的原因, 以热处理结合茎尖剥离脱除病毒和类病毒为目标, 筛选费乌瑞它马铃薯茎尖分化成苗最适宜的培养基, 并通过RT-PCR方法检测再生苗病毒和类病毒的脱毒率, 为脱毒苗扩繁和种薯繁育奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 马铃薯无菌苗体系 采集田间疑似带毒马铃薯植株的块茎, 低温休眠后, 室温暗处催芽, 消毒后接种在MS固体培养基上培养, 待成苗后扩繁, 从而建立马铃薯无菌苗体系。用RT-PCR方法检测并挑选分别含有3种病毒 (PVX、PVY、PLRV) 和纺锤块茎类病毒 (PSTVd) 的2种材料, 由榆林学院生命科学学院保存备用。 1.1.2 trizel试剂 培养基及不同植物生长调节剂所含药品, 均购自北京康贝斯生物科技有限公司;病毒检测的Trizol试剂购自invitrogen公司;c DNA合成试剂盒、Taq DNA聚合酶、d NTP、琼脂糖等购自北京全式金生物科技有限公司。 1.1.3 -catagcgt-3 根据Gen Bank数据库上PVX、PVY、PLRV的CP基因序列和PSTVd全基因组序列, 利用软件Primer 5设计4对特异引物, 分别是:PVX-F:5′-ACAGGCCACAGGGTCAACTAC-3′, PVX-R:5′-CATCTAGGCTGGCAAAGTCGT-3′;PVY-F:5′-GCCAACTGTGATGAATGGGC-3′, PVY-R:5′-TGTACTGATGCCACCGTCCA-3′;PLRV-F:5′-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3′, PLRV-R:5′-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3′;PSTVd-F:5′-GATCCCCGGGGAAACCTGGAGC-3′, PSTVd-R:5′-GATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAG-3′。 预期PVX、PVY、PLRV的CP基因序列和PSTVd全基因组序列的扩增片段大小分别为620、400、336和251 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成, 用灭菌TE (p H 8.0) 稀释至浓度为10μmol/L。 1.2 方法 1.2.1 诱导诱导病毒培养 取生长至高约1~2 cm的马铃薯无菌苗, 在植物培养箱内升温1℃/d驯化20 d左右, 然后38℃光照培养4 h、24℃光照培养12 h, 光照度3 000 lx, 最后20℃暗培养8 h, 变温热处理4周以钝化病毒。 1.2.2 培养基的组成 以MS为基本培养基, 添加不同质量浓度配比的植物生长调节剂, 其中, 细胞分裂素6-BA的6个浓度分别为0、0.025、0.050、0.075、0.100、0.150 mg/L, 生长素NAA的4个浓度分别为0、0.025、0.050、0.075 mg/L, 赤霉素GA3的浓度为0.100 mg/L, 共组成24种培养基, 蔗糖30 g/L, 卡拉胶5 g/L, p H 5.8。 1.2.3 愈伤组织的诱导率 剪取热处理后长势较好的无菌苗 (部分扩繁无菌苗因耐热差而长势弱或死亡) , 以注射器针代替解剖针在40倍的体视显微镜下进行茎尖剥离。因剥离茎尖越大, 成活率越高, 但脱毒率低, 为提高再生苗的脱毒率, 试验全部剥离带1个叶原基的茎尖, 茎尖大小约0.1~0.2 mm, 壮苗茎尖稍大, 弱细苗茎尖稍小。培养温度24℃, 光照时间16 h/d, 光照度3 000 lx。 为了降低污染率, 每个试管只接种1