HL-J6抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因转录组学研究.docxVIP

? ? HL-J6抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因转录组学研究* ? ? 段 浩，刘婧怡，曹 宇，张珊珊，李海波，马 雷 （1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.中国人民解放军陆军军医大学药学与检验医学系微生物与生化药学教研室，重庆 400038；3.重庆市沙坪坝区陈家桥医院检验科，重庆 400038；4.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154007） 金黄色葡萄球菌为葡萄串状的革兰阳性菌，败血症、脓毒血症、坏死性筋膜炎等多种临床疾病都可能由金黄色葡萄球菌感染所致[1］。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是临床常见的耐药菌，其造成的感染已成为世界三大难治感染性疾病之一[2］。近年来，抗生素滥用导致其对金黄色葡萄球菌的疗效逐渐变差，耐药问题变得十分严重[3］。万古霉素治疗MRSA不仅会产生耐药性，还会导致低血压、中性粒细胞减少等不良反应，剂量不足和治疗时间延长还会升高最低抑菌浓度（MIC），从而导致疗效欠佳或治疗失败等情况[4］，故常与利福平联用，然而耐利福平金黄色葡萄球菌分离株出现的频率逐年升高，有研究发现，金黄色葡萄球菌对利福平产生耐药性可能与rpoB基因的突变相关[5］。通过基因转录组测序（RNA-seq）技术可了解化合物作用于金黄色葡萄球菌后发生了相应变化的基因，再通过基因本体论（GO）富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析可了解其功能，从而揭示特定生物学过程及疾病发生过程的分子机理。与其他技术相比，RNA-seq有灵敏度高、高通量、高分辨率、成本相对较低等显著优势[6］。近年来，新型吲哚苯醌类药物HL-J6被认为具备高MRSA抑制性能。该药物对MRSA有抗菌活性，具备一定的临床应用价值，有望为临床防治MRSA提供新思路、新途径。但其抗菌的具体机制尚未明晰。因此，本研究中采用RNA-seq技术对经药物处理和未经处理MRSA菌株的基因转录组水平进行分析后，根据NCBI，UniProt等网站的功能注释，对表达产生变化的基因进行研究，从而探讨HL-J6抑制MRSA可能的机制。现报道如下。 1 材料和方法 1.1 仪器、试药与菌株 仪器：HFSAFE-1500型生物安全柜（力康生物医疗科技控股有限公司）；ZWY-211C型恒温培养振摇器（上海智城分析仪器制造有限公司）；CFX96 Touch型荧光定量聚合酶链反应仪（百乐科技有限公司）。 试药：苯唑西林（北京索莱宝生物科技有限公司，批号为O8350）；头孢唑林（上海吉至生化科技有限公司，批号为C29510）；氨苄西林（上海生工生物工程股份有限公司，批号为A610028-0025）；万古霉素（上海易恩化学技术有限公司，批号为1404-93-9）；利奈唑胺（批号为L830356）、莫匹罗星（批号为M812891），均购自上海麦克林生化科技有限公司；HL-J6（四川大学华西药学院何菱教授团队合成）；MHB培养基（北京索莱宝科技有限公司，批号为M8556）。 菌株：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA252；甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）标准菌株ATCC25923，均购于美国菌种保藏中心（ATCC）。 1.2 方法 菌株培养：从-80℃冰箱中取出甘油保种冻存的MRSA252和ATCC25923，分别接种至MHB固体培养基中，37℃培养24 h，随后挑取单菌落接种至MHB液体培养基中，37℃培养过夜，取200μL菌液至20 mL培养基中，37℃摇动培养5～6 h（此时细菌活力最强），备用。 MIC和最低杀菌浓度（MBC）测定：采用微量肉汤稀释法检测苯唑西林、头孢唑林、氨苄西林、万古霉素、莫匹罗星、利奈唑胺、HL-J6对上述2种菌株的MIC。将2种菌株菌液稀释至105cfu/mL，取196μL于96孔板中，随后加入4μL上述各药液稀释，使其最终质量浓度为128.0，64.0，32.0，16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.5μg/mL。37℃培养24 h后，肉眼观察MHB培养基的浑浊度，无浑浊时的药液最低质量浓度即为该药物的MIC[7］。吸取肉眼观察无细菌生长的96孔板中的液体100μL，接种至MHB培养皿中，培养过夜，观察培养皿上的菌落数[7］，以无细菌生长固体培养基对应的药液质量浓度为MBC。 细菌样本制备及RNA-seq：首先，挑取三段划线法接种的MRSA252单菌落，接种至MHB液体培养基中活化后，取200μL菌液加入20 mL培养基中，37℃振摇培养5～6 h。随后分别取4 mL菌液，各依次加入0.5，0.625，0.75，0.875，1倍MIC的HL-J6，37℃振摇培养3 h，由于0.75倍MIC是不抑制细菌生长的最高药物质量浓度，故取加入0.75倍MIC的菌液2 mL作为实验组放入保种管中急冻，并与对照组