基于h-2基因的近交系小鼠遗传检测方法的建立.docxVIP

基于h-2基因的近交系小鼠遗传检测方法的建立 交叉移植是生物因素的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。 目前微孔板Southern杂交技术较传统的Southern杂交技术具备简捷、客观、灵敏等优点而得到突飞猛进的发展。我们利用该方法的优点,结合遗传检测工作的实际建立了近交系小鼠H-2Southern杂交检测技术,目前,该遗传检测技术在国内还未见报道。 1 材料和方法 1.1 实验动物的来源 C57BL/6、C57BL/10、B6D2F1、DBA/2、 BALB/c 、Scid 、615、C3H、NCPC/2、TA1、TA2、T739,12个品系的近交系小鼠均由北京国家啮齿类实验动物种子中心提供,实验动物生产许可证号SCXK(京)2000-0010。B6D2F1是根据需要利用雌性C57BL/6小鼠和雄性DBA/2小鼠杂交所得。 1.2 聚糖烷酮探针 Taq DNA酶、蛋白酶K(20mg/mL)(5U/μL)购于宝生物公司(大连);聚蔗糖(Ficoll400)和聚乙烯吡咯烷酮 购于Sigma公司;生物素标记的探针均由上海生工北京分公司合成;亲和素标记的辣根过氧化物酶购于华美公司。 1.3 实验方法 1.3.1 提取氨基酸基因的dna 酚氯仿抽提法从鼠尾中提取上述12个品系小鼠的基因组DNA。 1.3.2 k型探针的结构 H-2D区b型探针序列如下:35bp CCTCTCTTTAGGGACTTCGCGATGCACGACTAGAC H-2D区k型探针序列如下:36bp TTTCTCTGTATAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACT H-2D区d型探针序列如下:23bp AGACCAGGCTGGCCTTGACTCAG 1.3.3 pbs-tween20的制备 取基因组DNA各10μL于100℃水浴中加热变性5min立即放入冰盒,置于-20℃低温冰箱5min;在酶标板的微孔内分别加入变性的DNA 10μL,再加入固定液至100μL,37℃恒温孵箱孵育2h; PBS-Tween 20漂洗2次,每次2min;加入100μL杂交液,1.0μL探针,使探针的终浓度为500ng/mL;封口,68℃水浴摇床轻摇20min;倒掉反应液,用2×SSC于68℃漂洗2次,每次2min; 用1×SSC于37℃漂洗2次,每次2min;用0.2×SSC于室温漂洗2次, 每次2min;加入1∶200亲和素标记的辣根过氧化物酶(10%小牛血清用PBS pH 7.4配制)100μL 于37℃恒温孵箱孵育1h;PBS-Tween20漂洗5次,每次3min;加入显色液100μL,避光显色15min;加入50μL终止液(2mol/mL H2SO4);酶标仪检测结果。 2 结果 2.1 待检dna与探针反应孔a值 参照实验动物病毒抗体ELISA诊断标准 ①待检DNA与特异探针反应孔的A值阴性DNA对照与特异探针反应孔的A值≥2.1;② 待检DNA与特异探针反应孔的A值≥0.2;③ 待检DNA与探针对照反应孔和待检DNA与特异探针反应孔应有明显的颜色区别,符合以上三个条件,判为阳性。 2.2 lisa检测结果 根据酶标仪检测的结果可知H-2b型近交系小鼠C57BL/6和C57BL/10与探针b发生了特异反应,数据符合上述标准,因此可以确定这两种近交系小鼠的H-2基因型为b型;DBA/2、BALB/c和Scid与探针d发生了特异反应,所以这三种近交系小鼠的H-2基因型为d型;C3H和615与k型探针发生了特异反应,因此这两种近交系小鼠的H-2基因型为k型。国内品系NCPC/2、TA1、TA2和T739均和b型探针发生了特异反应,因此可确定这几种近交系的H-2基因型为b型。检测结果见表1 。表1是酶标仪检测结果的具体数据,根据表中的数据按照上述标准进行计算,进行各种近交系小鼠品系的推断。 参照实验动物病毒抗体ELISA诊断标准根据表中原始数据进行计算如下: 其中Ab代表该品系与b型探针反应后的A值,Ad代表该品系与d型探针反应后的A值,Ak代表该品系与k型探针反应后的A值。 根据公式2.1①计算所得的结果如表2显示,文中所有近交系动物的计算结果均符合本公式的标准,同时待检DNA与特异探针反应孔的A值均≥0.2,且均有明显的颜色区别。所以根据上述标准可以判定个品系的H-2基因型。 3 pcr和资料处理的h-2基因型的确定 近交系小鼠遗传质量检测,从形态学、细胞学水平已发展到了分子生物学水平。形态学、细胞生物学水平的检测方法虽各具优点,使用广泛,但都是观察基因的表现型,没有从基因本