miR-216a通过下调CAPN6抑制宫颈癌细胞增殖并促进细胞凋亡的研究.docxVIP

? ? miR-216a通过下调CAPN6抑制宫颈癌细胞增殖并促进细胞凋亡的研究 ? ? 张贤雨，马 欢，宋凤丽，张志林 (1.河北北方学院附属第一医院放疗科，河北 张家口 075000；2.北京中医药大学第三附属医院放疗科，北京 100029) 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，居女性癌症的第二位。近年来随着现代社会生活节奏的加快，宫颈癌患者趋于年轻化，其对女性生育及健康造成严重危害[1]。宫颈癌的病因涉及致癌基因激活、抑癌基因抑制等多种复杂的分子机制，而宫颈癌患者预后较差及生存期短均与宫颈癌发病机制密切相关。因此，寻找宫颈癌发生及进展的相关分子生物学标志物，明确有效的分子靶点，对宫颈癌患者的临床治疗效率具有重要应用价值[2-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是机体重要的非编码单链小RNA分子，作为基因表达的重要调控因子，其异常表达与肿瘤形成和进展密切相关，已成为肿瘤分子靶向治疗的研究热点[4-5]。研究显示，微小RNA-216a(microRNA-216a，miR-216a)在非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤中异常表达并参与肿瘤的发生发展，但其在宫颈癌中的作用及调控机制尚不清楚[6-8]。钙激活中性蛋白酶(calcium activated neutral protease，CAPN)是一组细胞内Ca2+依赖的半胱氨酸水解酶，可催化多种底物参与一系列细胞生物学过程[9]。钙激活中性蛋白酶6(CAPN6)是非典型的CAPNs，主要表达于哺乳动物胚胎肌肉、胎盘，在出生后表达下降[10]。研究发现，CAPN6在人子宫肉瘤、子宫肌瘤等生殖器官肿瘤组织中异常表达[11]，miR-216a可通过靶向抑制CAPN6表达而抑制子宫肌瘤细胞增殖、促进细胞凋亡[12]。本研究探讨了miR-216a对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响及与CAPN6相关的作用机制。 1资料与方法 1.1临床资料 收集2019年5月至2021年5月于河北北方学院附属第一医院行手术治疗的82例宫颈癌患者的宫颈癌组织及癌旁正常组织。患者年龄为28～59岁，平均年龄(42.53±7.16)岁，均经病理检测确诊，术前未进行化疗、放疗等治疗。病理类型：宫颈腺癌19例(23.17%)，宫颈鳞状细胞癌63例(76.83%)；国际妇产科联盟(FIGO)临床分期：Ⅰ期36例(43.90%)，Ⅱ期25例(30.49%)，Ⅲ期21例(25.61%)；癌旁正常组织距宫颈癌组织3cm，病理证实无肿瘤浸润、转移等病变。本研究经河北北方学院附属第一医院医学伦理委员会批准(K20190425082)，患者及家属均知情同意。 1.2材料和试剂 人宫颈癌HeLa细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)；胎牛血清、RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；miR-216a模拟物(miR-216a mimic)及模拟对照序列(mimic-NC)、CAPN6小干扰RNA(si-CAPN6)及乱序无意义阴性序列(si-NC)(广州锐博生物科技公司)；CAPN6过表达质粒(pcDNA-CAPN6)及空载质粒(pcDNA-NC)(美国Origene公司)；Trizol试剂和LipofectamineTM2000试剂盒(美国Invitrogen公司)；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒；人膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技公司)；逆转录试剂盒和qRT-PCR(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；兔抗切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(B cell CLL/lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、CAPN6、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的IgG二抗(美国Abcam公司)。 1.3实验方法 1.3.1 HeLa细胞培养 将人宫颈癌HeLa细胞接种于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素)，在37℃、