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? ? OsCYP96B4等位突变体的抗病性分析 ? ? 蔡林军， 员菡， 孙航， 郭云霞， 彭西蔓， 戴继超, 桑贤春， 张长伟 西南大学 水稻研究所/转基因植物与安全控制重庆市重点实验室/农业科学研究院,重庆 400715 纹枯病(RhizoctoniasolaniKühn)作为一种水稻的常见真菌性病害,严重威胁着粮食安全.目前的研究发现,水稻对纹枯病的抗性仅表现为中等水平,且易受环境的影响,迄今尚无稳定高抗的抗源.水稻纹枯病菌在入侵水稻时,主要是通过气孔或者伤口直接攻击水稻的表皮细胞,进而进入水稻植株体内.其菌丝在穿过气孔后,可形成侵染垫(卷曲菌丝聚集体),侵染垫能产生降解植物细胞壁的酶,为真菌进入植物组织打开通道[1].在进入水稻体内后,纹枯病菌能够产生病原体效应物,这是一类RS(Rhizoctonia solani)毒素,能够破坏水稻组织,加速对水稻植株的入侵和传播[2].收获后的菌核遗落在田间,越冬后,在第2年继续形成传染源,这也是纹枯病防治难度大的原因.在水稻中,目前还没有克隆出有关水稻纹枯病抗性相关的基因.在Sato等[3]的研究中,利用WSS2(抗病品种)与Hinohikari(感病品种)先自交后回交,鉴定到qSB-3和qSB-12两个主效数量性状基因座(Quantitative trait locus,QTL).另外两个纹枯病抗性qSB11和qSB9,均来自供体Lemont(抗病品种).向珣朝等[4]的研究中发现了Rsb-2(t),一个来自于3号染色体的纹枯病抗性主效QTL． 细胞色素P450(cytochrome P450)是一个十分古老的基因家族,在动物、植物、真菌和细菌的细胞内广泛存在,在生物体内的细胞色素P450是一类能够与细胞器膜(内质网、线粒体、高尔基体、质体等)结合的且具有混合功能的血红素氧化酶系,是近年来研究的热点之一.在水稻的防御机制中,CYP450有着不可替代的作用.CYP71Z2在水稻的防御机制中起作用,该基因能够通过IAA途径介导对白叶枯病的抗性[5].HAN1在调控植物的逆境应答(冷胁迫和低温胁迫)机制中起作用,在JA途径中催化活性茉莉酸-L-异亮氨酸的转化,负调控水稻的耐寒性[6].CYP94C2b和HAN1一样,也通过催化活性茉莉酸-L-异亮氨酸的转化,进而降低水稻对外源JA的响应和损伤的应答[7].OsSL编码的CYP71P1蛋白具有色胺5羟化酶活性,在色胺转变成血清素的过程中起催化作用,血清素能够诱导防御基因的表达在水稻防御机制中发挥作用[8].此外,外源5-羟色胺诱导水稻防御基因的表达和细胞的程序化死亡,并增加水稻对稻瘟病的抗性.CYP76M7在抗真菌素中起作用,在水稻第2个二萜类生物合成基因簇中起决定作用.这个基因簇是多功能的,包括合成两类不同植保素(抗真菌素和抗细菌素)的酶,并且通过不同的转录调控相应的基因[9].CYP81A6具有对苯达松和磺脲类除草剂的抗性[10].在CYP72A31的作用下,双草醚和苄嘧磺隆能够被代谢为一种毒性更小的复合物,进而提高拟南芥和水稻对抑制剂类除草剂(乙酰乳酸合成酶)的耐受性[11]． 在前期研究中,通过EMS化学诱变处理籼稻保持系西农1B获得了4个遗传稳定的水稻矮化易感纹枯病的突变体,dssb1,dssb1-1,dssb1-2和dssb1-3.本研究通过构建F2群体进行连锁分析,采用图位克隆的方法精细定位目标基因,并通过形态学分析、组织化学切片、目标基因的功能分析等手段对该突变体进行表型鉴定及目的基因的功能分析,更深入地了解该基因的分子调控机制,以期为水稻抗病育种提供参考． 1 材料与方法 1.1 实验材料 水稻矮化纹枯病易感突变体dssb1,dssb1-1,dssb1-2和dssb1-3,由西南大学水稻研究所培育的保持系西农1B(籼稻)经过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变剂处理得到的.白叶枯病菌株(zhe-173),中国水稻研究所侯雨萱老师馈赠； 纹枯病菌株(RH-9),扬州大学潘学彪老师提供； 大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞原液,购自北京TransGen Biotech技术有限公司； PAN580亚细胞定位质粒,南京农业大学万建民实验室馈赠． 1.2 实验方法 1.2.1 农艺性状考察 水稻种植于西南大学歇马镇水稻基地,按常规模式进行田间管理.成熟后,随机收获10株,对主要的农艺性状进行考察,调查结果进行t检验． 1.2.2 抗病性分析 参照潘学彪等[12]的短牙签嵌入法接种水稻纹枯病菌,接种后的第7 d,14 d对野生型和突变体的发病情况进行统计． 水稻白叶枯病抗性的鉴定方法：将在斜面培养基上已活化的病菌刮取一环接种至培养基中,置于28 ℃,120 r/min的摇床培养24～48 h,采用麦氏比浊