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利用多孔微载体大规模培养动物细胞的研究 动物的细胞培养始于本世纪初。1962年,其规模开始扩大,发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。大量资料表明,生物技术药物是当前新药开发的重要领域,生物技术制药工业是下一个10年制药工业的重要新门类,期间将有数百种生物技术新药上市。美 国最新预测几种畅销基因工程药物2000年全球销售额EPO大于30亿美元,G-CSF大于20亿美元,HGH、IFN、UK均大于10亿美元,胰岛素和降钙素大于5亿美元。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。 1 细胞生长的维持 在大规模培养动物细胞的过程中,最根本的是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响,维持细胞高存活力和高效表达,同时又要充分考虑细胞表达产物的后续纯化。 1.1 无血清培养基 动物细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。目前,大规模动物细胞培养中已经普遍使用无血清培养基,在此之前使用过天然培养基、合成培养基。无血清培养基避免了血清培养基污染的可能性,并减少了纯化的难度。但无血清培养基没有广泛的适应性,不同的细胞甚至不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血型培养基配方。如在DMEM∶F12(1∶1)培养基中添加了Se、乙醇胺、多种维生素、蛋白胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子,构成了SFM-p。SFM-p不含牛血清白蛋白而能维持细胞生长和rHuEPO的生产。但采用无血清培养而诱发的细胞凋亡也成为动物细胞无血清培养技术中急待解决的问题。在培养基中加入某些化合物,如金精三羧酸(ATA)、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等,在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导致的细胞凋亡。 1.2 生物反应器的发展 动物细胞的大规模培养需要特殊的生物反应器。与微生物和植物细胞不同,动物细胞的外层是质膜,脆性大,在反应器中务必减少剪切力。自70年代以来,用于动物细胞培养的生物反应器有很大的发展,种类越来越多,规模越来越大。根据生物反应器的用途不同,有悬浮培养用、贴壁培养用和包埋培养用生物反应器等。 1.2.1 外循环式生物反应器 气升式生物反应器的基本原理是气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管,使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。气升式生物反应器主要采用内循环,但也有采用外循环式。1979年Katinger等首次应用气生式生物反应器进行动物细胞悬浮培养。英国Celltech公司是应用气生式生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例,1985年应用100 L规模的气生式生物反应器进行大规模培养杂交瘤细胞。该公司已经开发出了10 000 L规模的气生式生物反应器用于各类单抗的大量生产。国内已经有人设计制造了10 L规模的气生式生物反应器用于培养哺乳动物细胞、昆虫细胞等各类生物制品。 1.2.2 毛细管生长表面积 其原理为泵动培养液通过成束的合成空心纤维管(毛细管)而使细胞固着在毛细管内壁生长。如果毛细管的直径为350 μm,表面积/体积比率为30.7,大量成束的毛细管内壁提供了大量的生长表面积。它的用途较广,既可培养悬浮生长的细胞,又可培养贴壁依赖性细胞,细胞密度最高可达109mL-1。主要用于杂交瘤细胞生产单克隆抗体。 1.2.3 材料好的反应器,细胞分离 流化床生物反应器的基本原理是培养液通过反应器垂直向上循环流动,不断提供给细胞必要的营养成分,使细胞得以在微粒中生长;同时,不断加入新鲜培养液。这种反应器的传质性能好,并在循环系统中采用膜气体交换器,能快速提供给高密度细胞所需要的氧,同时排出代谢产物;反应器中的液体流速足以使细胞微粒悬浮却不损坏脆弱的细胞。流化床生物反应器满足了高密度细胞培养,使高产量细胞长时间停留在反应器中,优化了细胞生长与产物合成的环境等细胞培养的要求。可用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞的培养。 1.2.4 个数字控制装置dcu B.Braun MD10搅拌罐生物反应器,内装一个100 μm孔径的旋转滤器,工作体积为8 L。一个数字控制装置(DCU)用于控制温度、pH值、搅拌速度和溶氧(DO)。底部的环形喷气结构起通气作用。新鲜培养基分散进入旋转滤器的外部区域,从旋转滤器的中间获得无微载体的收集液。旋转滤器一般由不锈钢丝网构成,有良好的生物相溶性,易于清洗和消毒,可重复和长期使用。这种装置已经大规模悬浮培养多种细胞。 1.2.5 减少固化床内的线性流速,