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利用反向遗传学方法敲除细胞基因 丝虫菌占真菌世界的很大一部分，在工业、农业、医学和基础生物学研究中发挥着重要作用。一些重要的工业菌株用于生产酶、有机酸等物质,如黑曲霉、绿色木霉等。一些与农业生产有着重要的关系,既是重要农作物上的病原菌,如稻瘟病菌、棉花黄萎病菌等;又是生防真菌,具有防治植物病虫害的功能,如绿僵菌、木霉菌等。另一些丝状真菌在医药上有着举足轻重的作用,如来源于海洋的丝状真菌、一种新型的可以产生抑制癌细胞扩散物质的灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)。同时,由于丝状真菌中的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)基因组相对简单、可操作性强,可作为“模式”种用于真核生物的一些生物学特性研究。随着大量丝状真菌基因组序列的测定以及高效分子研究手段的发展,以基因功能鉴定为目标的功能基因组学已经成为目前生命科学领域研究的热点。目前已有一些方法用于丝状真菌基因功能的研究,如转座子标签法、基因敲除技术、RNA干扰、超表达及酵母杂交系统等。其中基因敲除技术能够有效和特异性地抑制目标基因的表达,操作简单易行,是构建许多真菌基因突变体的首选技术,故应用十分广泛。 1995年Paul Bundock首次应用农杆菌实现了对酿酒酵母的转化,1998年de Groot等构建了农杆菌介导(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)丝状真菌转化体系。该方法操作简单、受体范围广、转化效率高、单拷贝率高及突变体遗传稳定,解决了传统转化方法的瓶颈。农杆菌介导的遗传转化方法已是目前实现真菌遗传转化应用最广泛的方法之一。利用该方法成功转化的真菌已有100种,而且已有多种真菌利用该方法构建了含丰富类型转化子的突变体库,通过突变体表型来筛选特定的基因。另外,随着真菌基因组测序的完成,使得ATMT结合反向遗传学的方法定向分析基因的功能成为了可能。 1 基因打靶技术 基因敲除技术是20世纪80年代末发展起来的一种研究基因功能的新型技术。此后经历了将近20年的推广和应用,直到2007年10月8日,美国科学家Capecchi和Oliver Smithies、英国科学家Evans因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,基因打靶技术才获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。早在1973年,Mishra等首次报道了丝状真菌粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的DNA转化现象,他们用野生型菌株的总DNA处理肌醇缺陷型菌株,获得了肌醇原养型转化菌株,但受到质疑;因为在当时普遍认为真核生物发生转化几乎是不可能的,上述实验的结果有可能是由于回复突变造成的。Mishra改进了设计,用含有温度敏感肌醇等位基因突变菌株的DNA来处理肌醇缺陷型菌株,得到了温度敏感转化菌株。随后,Case等证实DNA介导的粗糙链孢霉遗传转化,在转化子中含有整合于染色体上的质粒DNA片段。此后据不完全统计,已有超过100种丝状真菌实现了转化(表1)[20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31]。 2 关于丝状真菌基因的提取技术的研究 2.1 基因缺失修饰 基因敲除(Gene knockout)又称基因打靶(Gene targeting),是对序列已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除或用其它顺序相近的基因取代,根据宿主的形态、生理生化特性等的变化来推测相应基因的功能。绝大多数的基因敲除策略都是基于同源重组(Homologous recombination,HR)机制。利用此技术可以在分子水平上将目标基因进行定向修饰,包括基因失活、引入点突变、缺失突变和插入外源片段等,并可将修饰后的遗传信息在生物体内表达,从而通过表型的变化揭示目标基因的功能。目前已有多种真菌构建了含丰富类型转化子的突变体库。 2.2 同源序列双交换现象 通过同源重组(HR)整合外源基因的效率在不同种甚至不同菌种之间是不同的。目标整合依赖于目标基因两端与选择标记基因两端的同源序列之间双交换(图1)。基因同源重组现象首次在哺乳动物细胞中证实存在,这为基因敲除技术的创立奠定了理论基础。之后近20年来,此技术已经由在酵母和哺乳动物中的应用,拓展到了植物、真菌基因功能研究中,主要包括敲除载体构建、敲除载体的真菌转化、转化子筛选和目的敲除转化子鉴定等。 2.2.1 in-sfson克隆技术 敲除载体由四部分组成,包括与靶序列两端同源的同源臂序列(HRS1和HRS2),中间的筛选标记基因序列以及载体序列。大多数已报道的对目的基因进行研究的方法都基于传统的克隆策略来构建敲除载体,包括体外转座子突变、酶切连接